连接蛋白40、43基因表达水平对绒山羊毛囊生长发育相关基因表达的影响

发布时间：2025-01-14 07:08

　　细胞间隙连接(gap junction)由若干连接蛋白构成,在毛囊生长发育的细胞信号转导过程中起到十分重要的作用。在之前的研究中发现,通过高通量转录组测序方法得到的绒山羊皮肤毛囊静息期和生长期差异表达的基因中,连接蛋白40(Connexin40, Cx40)和连接蛋白43(Connexin43, Cx43)的表达存在明显差异。本研究选取Cx40和Cx43基因作为研究对象,探讨两种基因是否在绒山羊毛囊生长发育中起到重要的调控作用,从而为进一步研究绒山羊毛囊生长发育的基因调控系统提供实验依据。 本研究成功分离得到了绒山羊初级毛乳头细胞、次级毛乳头细胞和表皮细胞,并分析了这3种细胞中Cx40和Cx43基因的表达情况；同时,通过进一步对绒山羊皮肤进行检测发现,Cx40和Cx43基因在绒山羊皮肤毛囊生长期转录表达水平显著高于静息期。 通过RT-PCR技术成功克隆了Cx40和Cx43基因的CDS序列；将两段序列分别插入到了真核表达载体pIRES2-EGFP中,成功构建了pIRES2-EGFP-Cx40载体和pIRES2-EGFP-Cx43载体；将上述两种载体通过脂质体转染的方法对绒山羊初级毛...

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
目录
缩略词表
第一部分 实验研究
    第一章 Cx40和Cx43基因在绒山羊毛囊相关细胞及皮肤毛囊周期性变化的表达验证
        1 引言
        2 材料
            2.1 主要材料
            2.2 主要仪器设备
                2.2.1 分子实验所用
                2.2.2 细胞实验所用
            2.3 主要试剂及耗材
                2.3.1 分子实验所用
                2.3.2 细胞实验所用
        3 方法
            3.1 分离及培养三种绒山羊毛囊相关细胞
                3.1.1 分离及培养初级毛乳头细胞
                3.1.2 分离及培养次级毛乳头细胞
                3.1.3 分离及培养表皮细胞
            3.2 验证三种绒山羊毛囊相关细胞Cx40和Cx43基因的表达
                3.2.1 获取三种绒山羊毛囊相关细胞总cDNA
                3.2.2 设计Cx40和Cx43基因CDS序列PCR扩增引物
                3.2.3 检测三种绒山羊毛囊相关细胞Cx40和Cx43基因表达情况
            3.3 验证Cx40和Cx43基因在绒山羊皮肤毛囊静息期和生长期的差异表达
                3.3.1 获取绒山羊皮肤毛囊静息期和生长期的皮样总cDNA
                3.3.2 设计Cx40和Cx43基因及GAPDH内参基因CDS序列qPCR扩增引物
                3.3.3 检测Cx40和Cx43基因及GAPDH内参基因CDS序列qPCR扩增引物的特异性
                3.3.4 检测绒山羊皮肤毛囊两个时期皮样Cx40和Cx43基因的相对表达量
        4 结果
            4.1 分离及培养三种绒山羊毛囊相关细胞的结果
                4.1.1 分离及培养初级毛乳头细胞的结果
                4.1.2 分离及培养次级毛乳头细胞的结果
                4.1.3 分离及培养表皮细胞的结果
            4.2 验证三种绒山羊毛囊相关细胞Cx40和Cx43基因的表达的结果
            4.3 验证Cx40和Cx43基因在绒山羊皮肤毛囊静息期和生长期的差异表达的结果
        5 讨论
        参考文献
    第二章 Cx40和Cx43基因真核表达载体的构建及绒山羊毛囊相关细胞的转染
        1 引言
        2 材料
            2.1 主要材料
            2.2 主要仪器设备
                2.2.1 分子实验所用
                2.2.2 细胞实验所用
            2.3 主要试剂及耗材
                2.3.1 分子实验所用
                2.3.2 细胞实验所用
        3 方法
            3.1 克隆Cx40和Cx43基因CDS序列
                3.1.1 获取绒山羊胎儿成纤维细胞总cDNA
                3.1.2 克隆Cx40和Cx43基因CDS序列
                3.1.3 检测Cx40和Cx43基因CDS序列克隆结果
            3.2 构建插入Cx40和Cx43基因CDS序列的转染载体
                3.2.1 构建pIRES2-EGFP-Cx40和pIRES2-EGFP-Cx43载体
                3.2.2 检测pIRES2-EGFP-Cx40和pIRES2-EGFP-Cx43载体构建结果
            3.3 筛选转Cx40和Cx43基因的细胞系
            3.4 检测转Cx40和Cx43基因的细胞系
                3.4.1 获取6种转基因细胞系和3种非转基因细胞系总cDNA
                3.4.2 设计Cx40和Cx43基因CDS序列qPCR扩增引物
                3.4.3 检测Cx40和Cx43基因CDS序列qPCR扩增引物的特异性
                3.4.4 检测转基因细胞系与非转基因细胞系Cx40和Cx43基因的相对表达量
        4 结果
            4.1 克隆Cx40和Cx43基因CDS序列的结果
            4.2 构建插入Cx40和Cx43基因CDS序列的载体的结果
            4.3 筛选转Cx40和Cx43基因的细胞系的结果
            4.4 检测转Cx40和Cx43基因的细胞系的结果
        5 讨论
            5.1 克隆Cx40和Cx43基因CDS序列的条件优化
            5.2 构建pIRES2-EGFP-Cx40和pIRES2-EGFP-Cx43载体的条件优选
            5.3 细胞转染方式的选择及优化
            5.4 转Cx40和Cx43转基因细胞系的检测分析
        参考文献
    第三章 Cx40和Cx43基因过表达对参与绒山羊毛囊生长发育相关基因表达影响的检测
        1 引言
        2 材料
            2.1 主要材料
            2.2 主要仪器设备
            2.3 主要试剂及耗材
        3 方法
            3.1 设计检测对照组及被检测基因CDS序列qPCR扩增引物
            3.2 检测绒山羊毛囊生长发育相关基因CDS序列qPCR扩增引物的特异性
            3.3 检测6种转基因细胞系与非转基因细胞系绒山羊毛囊生长发育相关基因的相对表达量
        4 结果
            4.1 基因VEGF转录表达情况
            4.2 基因IGF-1转录表达情况
            4.3 基因β-catenin转录表达情况
            4.4 基因HIF-1α转录表达情况
            4.5 基因胸腺素β4转录表达情况
        5 讨论
            5.1 关于基因VEGF的差异表达
            5.2 关于基因IGF-1的差异表达
            5.3 关于基因β-catenin的差异表达
            5.4 关于基因HIF-1α的差异表达
            5.5 关于基因胸腺素β4的差异表达
        参考文献
结论
图版1
图版2
附录
文献综述 细胞间隙连接(gapjunction,GJ)的研究进展
    1 结构组成
    2 功能调节
        2.1 电偶联信号传递作用
        2.2 代谢偶联信号传递作用
        2.3 调控作用
    3 研究方法
        3.1 细胞生物学的研究方法
        3.2 分子生物学的研究方法
    4 与人类疾病的联系
        4.1 与先天耳聋疾病的联系
        4.2 与心脏疾病的联系
        4.3 与肿瘤疾病的联系
    5 展望
    参考文献
致谢
硕士期间论文发表情况



本文编号：4026588