牛乳房炎金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立及初步应用

发布时间：2025-02-10 21:23

　　 为建立灵敏、快速、可视化的牛乳房炎金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)环介导等温扩增技术(LAMP),根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,分别优化反应条件和反应体系,进行特异性和灵敏度试验,并用优化后的方法对临床分离的金黄色葡萄球菌样品进行检测。结果表明,建立的方法可以在64℃反应60 min,得到清晰的梯状条带;反应产物经10×SYBR GreenⅠ染色后,肉眼直接观察或是紫外线照射之后均可判定结果;敏感性试验表明,与常规PCR相比,该方法检测到的金黄色葡萄球菌最低浓度为1×10～1 CFU/mL,灵敏度提高了100倍;该方法特异性良好,与大肠埃希菌、沙门菌、伪结核棒状杆菌均无交叉反应;31份临床分离的金黄色葡萄球菌样本检测的结果表明,该方法与传统的PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法特异性、灵敏度良好,可用于临床牛乳房炎金黄色葡萄球菌感染的检测。

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【部分图文】：

图1 LAMP外引物验证

使用沙门菌、大肠埃希菌和假结核棒状杆菌作为对照,在优化的条件下进行LAMP扩增。结果表明,仅在4号样本(金黄色葡萄球菌)中可电泳出梯形特异性条带(图3),反应产物经染色后于紫外灯下观察,可见仅有4号样本(金黄色葡萄球菌)出现绿色荧光,而其他扩增产物则为橙色;日光下,阳性产物(金黄....

图2 LAMP反应体系及条件优化

图1LAMP外引物验证图3金黄色葡萄球菌LAMP特异性试验

图3 金黄色葡萄球菌LAMP特异性试验

图2LAMP反应体系及条件优化2.4灵敏性试验

图4 金黄色葡萄球菌LAMP灵敏性试验

应用已经建立的金色葡萄球菌LAMP检测方法对31份奶牛乳房炎金色葡萄球菌菌液进行检测,并与常规PCR方法对比。结果显示,两者检测到阳性样品结果相同,表明LAMP与传统PCR方法特异性一致。3讨论

本文编号：4033081