三种牛泰勒虫的实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

发布时间：2017-06-28 21:20

  本文关键词：三种牛泰勒虫的实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：牛泰勒虫是寄生在牛体淋巴细胞和红细胞内的一种蜱传性寄生虫,引起牛发热、贫血、黄疸及体表淋巴结肿大等临床症状。我国存在的牛泰勒虫主要有环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫三种。牛泰勒虫病与蜱的活动、流行密切相关,因而该病呈现明显的季节性,呈地方性流行,很难彻底消灭;严重感染时甚至会引起死亡,给养殖业带来巨大经济损失和潜在威胁。本研究以核糖体r RNA的转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)为靶基因,分别设计针对环形泰勒虫、中华泰勒虫、东方泰勒虫的特异性引物和探针,建立了鉴别诊断三种牛泰勒虫的实时荧光PCR方法,并对国内部分地区的150份田间样品进行检测,同时对比与建立的普通PCR方法进行对比,对其敏感性和样品检出率进行了评价。主要研究内容如下:1.通过对18株牛泰勒虫ITS基因序列和8条牛的巴贝斯虫进行序列比对和分析,发现牛环形泰勒虫、中华泰勒虫、东方泰勒虫的各地理株之间有较高的保守性,种内地方株之间相似性分别高达91.8%~94.2%、99.2%~97.9%、99.1%~59.2%,环形泰勒虫与中华泰勒虫、东方泰勒虫的相似性分别是17%~35.6%、16.1%~35.7%,中华泰勒虫与东方泰勒虫的相似性40.2%~69.9%之间,而与相近的巴贝斯虫之间变异性更高,相似性仅为15.2%~40.8%,是较理想的诊断靶标。根据种间变异区和种内保守区,设计针对环形泰勒虫、中华泰勒虫、东方泰勒虫的特异性引物和探针。设计三种牛泰勒虫ITS基因的普通PCR引物,采用已发表的普通PCR方法,分别构建质粒标准品用于敏感性分析。2.成功建立了环形泰勒虫、中华泰勒虫、东方泰勒虫的Taq Man探针实时荧光定量PCR方法。并对其反应条件和体系进行了优化,结果显示这三种方法的反应性较好,反应曲线呈S型,有较好的扩增效率及线性相关性;,三种牛泰勒虫之间没有交叉反应,且与相近牛的大巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种喀什株没有交叉反应,特异性良好;可检测质粒标准品的最低浓度为100、101、101拷贝/μL,比普通PCR敏感性分别高100倍、1000倍、1000倍,敏感性较高;组内重复性实验变异系数Ct值均小于5%,组间变异系数均小于10%,重复性良好,3.对来自新疆、甘肃、内蒙古三个地区的150份血液样品进行检测,结果显示,环形泰勒虫实时荧光PCR检测及普通PCR检测方法检测阳性率分别为18%和8.66%;中华泰勒实时荧光PCR检测及普通PCR检测方法检测阳性率分别为22.6%和10%;东方泰勒虫实时荧光PCR检测及普通PCR检测方法检测阳性率分别为43.7%和18%。进一步对三种方法的检测结果分析,表明其中普通PCR检测的阳性样品在荧光定量PCR方法检测中也为阳性,而被荧光定量PCR检测为阳性的某些样品在普通PCR检测中表现为阴性。证明了Taq Man探针实时荧光定量PCR鉴定牛泰勒虫的可靠性及灵敏性。
【关键词】：牛泰勒虫 ITS 实时荧光定量PCR 检测
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 第一章 引言12-20
• 1.1 病原学特征12-13
• 1.2 生活史13
• 1.3 流行病学13-14
• 1.4 牛泰勒虫病诊断方法研究进展14-18
• 1.4.1 病原学诊断14-15
• 1.4.2 血清学诊断15-16
• 1.4.3 分子生物学诊断16-18
• 1.5 研究内容与目的18-20
• 第二章 靶基因的测序分析、引物和探针设计及质粒标准品的构建20-31
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 虫种和参考虫种信息20-21
• 2.1.2 主要试剂21
• 2.1.3 主要仪器21
• 2.2 实验方法21-27
• 2.2.1 牛泰勒虫ITS基因的序列比对及同源性分析21-22
• 2.2.2 引物及探针的设计合成22-24
• 2.2.3 全血基因组提取24
• 2.2.4 质粒标准品的制备24-27
• 2.3 结果与分析27-29
• 2.3.1 牛泰勒虫ITS基因序列比对及进化分析27-29
• 2.3.2 基因的扩增、克隆及测序29
• 2.4 讨论29-31
• 第三章 实时荧光定量PCR方法的建立及评价31-40
• 3.1 材料31
• 3.2 方法31-32
• 3.2.1 实时荧光定量PCR扩增31-32
• 3.2.2 荧光定量PCR标准曲线的建立32
• 3.2.3 TaqMan探针荧光定量PCR方法的评价32
• 3.3 结果与分析32-38
• 3.3.1 标准曲线的建立32-33
• 3.3.2 特异性实验33-34
• 3.3.3 敏感性实验34-36
• 3.3.4 重复性实验36-38
• 3.4 讨论38-40
• 第四章 我国部分地区牛泰勒虫荧光定量PCR检测40-45
• 4.1 材料40
• 4.1.1 样品来源40
• 4.1.2 主要试剂与仪器40
• 4.2 实验方法40-41
• 4.2.1 全血基因组提取40
• 4.2.2 探针及引物的合成40-41
• 4.2.3 普通PCR检测体系与程序41
• 4.2.4 荧光定量PCR检测体系与程序41
• 4.3 结果41-42
• 4.3.1 牛泰勒虫普通PCR检测结果41-42
• 4.3.2 牛泰勒虫实时荧光PCR检测结果42
• 4.4 普通PCR结果和实时荧光PCR检测结果比较42-43
• 4.5 讨论43-45
• 第五章 全文结论45-46
• 参考文献46-52
• 致谢52-53
• 作者简历53

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本文编号：495319