新疆哈萨克羊TLR8基因突变与绵羊肺腺瘤病毒易感性关系研究

发布时间：2017-08-08 16:41

  本文关键词：新疆哈萨克羊TLR8基因突变与绵羊肺腺瘤病毒易感性关系研究

  更多相关文章： TLR8基因 绵羊肺腺瘤病 多态性 易感性

【摘要】：Toll样受体(TLRs)是一种模式识别受体(pattern recognize receptor,PRR),由14个TLR成员组合而成,在先天性以及适应性免疫中扮演着重要的角色。现今已知TLR2,TLR3,TLR4和TLR7,TLR8,TLR9可引发抗病毒防御机制。绵羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenomatosis,OPA)是由绵羊肺腺瘤反转录病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)引起的一种慢性、接触传染性肺脏肿瘤性疾病,严重影响着全世界养羊业的发展。目前,Toll样受体和其它免疫应答基因的多态性已经被发现与疾病抵抗力和易感性紧密相关。本研究使用PCR-SSCP技术对新疆哈萨克羊TLR8基因多态性进行了分析,选取3只突变以及3只未突变的哈萨克羊进行绵羊肺腺瘤病毒感染实验,并且对其早期感染的炎性细胞及免疫细胞因子的水平进行了检测,在攻毒5个月后进行病理剖检观察和组织学观察,进一步探讨哈萨克羊TLR8基因突变与绵羊肺腺瘤病毒的易感性关系,为绵羊抗病选育提供理论支持。1.新疆哈萨克羊TLR8基因多态性分析采用PCR-SSCP方法对其突变进行了检测。发现P1、P5、P6三对引物所扩增的片段存在多态性,检测到4个突变位点,分别为G170A、G1307A、T1604C和A1628G,其中,G170A和G1307A为同义突变,T1604C和A1628G为错义突变,对应的氨基酸改变分别是Leu496Pro和Gln504Arg。对基因型频率和等位基因频率进行了计算,Hardy-Weinberg平衡检测结果为非平衡状态。2.哈萨克羊TLR8基因SNP突变对绵羊肺腺瘤病毒侵染后细胞因子影响利用患病羊肺脏组织制备绵羊肺腺瘤病毒悬液,进行绵羊肺腺瘤病感染实验,然后检测血液各项指标的变化,并用ELISA方法检测其感染早期炎性因子的水平。结果表明,制备病毒悬液经电镜观察,病毒直径约为80-100nm之间,绵羊肺腺瘤病毒接种后,每隔3小时测定的呼吸、脉搏等生理指标均未出现异常。血常规检测结果显示突变组与对照组绵羊的白细胞、淋巴细胞等炎性细胞都处于升高趋势,但组间差异并不显著。ELISA结果显示,突变组血清中γ-IFN、IL1-β及TNF-α水平均低于对照组,且组间差异显著。而突变组中TLR8和My D88的含量高于对照组,但组间差异不显著。本实验选取突变羊实施感染实验,通过对感染早期几个细胞因子水平的检测,发现TLR8基因突变的绵羊在接种病毒后炎性细胞因子水平低于未突变组,推测可能是由于TLR8基因SNP突变阻碍了机体免疫应答,以致于抗病毒、抗感染免疫受阻,从而导致病毒侵染机体后免疫调节减弱。3.人工感染绵羊肺腺瘤病后的病理学观察在感染绵羊肺腺瘤病毒5个月后,将突变组和对照组的实验羊解剖,观察其肺脏的病变情况,取肺病变组织制成切片在光学显微镜下进行病理学观察。对比攻毒后突变组和对照组的病理损伤程度。结果发现突变组绵羊的肺脏质地变实,有许多灰白色结节,形似肿瘤灶,并出现增生融合的肿块。而对照组绵羊的肺叶中仅出现了少量疑似肿瘤灶的结节,肺脏损伤程度低于突变组的绵羊。病理切片观察发现,突变组绵羊肺脏组织有大量形状不规则的腺瘤病灶,而对照组仅有少量支气管腔内出现腺瘤灶,多数肺泡仍保持原有的结构。综上所述,TLR8突变组的绵羊感染绵羊肺腺瘤病毒的病理损伤程度高于对照组绵羊,哈萨克羊TLR8基因突变对绵羊肺腺瘤病毒的易感性更强。
【关键词】：TLR8基因 绵羊肺腺瘤病 多态性 易感性
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.26
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 文献综述11-19
• 1.绵羊肺腺瘤病11-14
• 1.1. 绵羊肺腺瘤病概述11
• 1.2 绵羊肺腺瘤病的发现11
• 1.3 绵羊肺腺瘤病的流行病学11-12
• 1.3.1 易感动物12
• 1.3.2 传染源及传播途径12
• 1.4 绵羊肺腺瘤病的临床症状及病理变化12-13
• 1.4.1 临床症状12-13
• 1.4.2 病理组织学观察13
• 1.5 绵羊肺腺瘤的诊断13-14
• 1.5.1 病原鉴定14
• 1.6 综合防治14
• 2. Toll样受体14-17
• 2.1. Toll样受体家族概述14-15
• 2.2. Toll样受体分子的结构特点15
• 2.3. Toll样受体的信号转导途径15-16
• 2.4. Toll样受体的配体16-17
• 2.5. TLR8的免疫学功能17
• 3. PCR-SSCP技术17-19
• 3.1. PCR-SSCP技术概述17
• 3.2.PCR-SSCP技术的发展及应用前景17-18
• 3.3 基因突变的研究意义18-19
• 第二章 实验部分19-42
• 实验一 新疆哈萨克羊TLR8基因多态性分析19-28
• 1.材料与方法20-24
• 1.1 试验材料20-21
• 1.1.1 动物样品来源20
• 1.1.2 主要试剂20
• 1.1.3 试剂的配置20
• 1.1.4 仪器20-21
• 1.2 试验方法21-24
• 1.2.1 引物设计21
• 1.2.2 引物稀释21
• 1.2.3 提取基因组DNA21-22
• 1.2.4 PCR扩增22
• 1.2.5 PCR-SSCP分析22-23
• 1.2.6 PCR产物回收23
• 1.2.7 目的片段与载体的连接转化23
• 1.2.8 菌落PCR检测23-24
• 1.2.9 质粒的提取24
• 1.2.10 PCR产物测序24
• 1.3 数据统计分析24
• 2. 结果与分析24-26
• 2.1 PCR扩增结果24-25
• 2.2 PCR-SSCP分型结果25
• 2.3 测序结果25-26
• 2.4 哈萨克羊TLR8基因的基因型频率、基因频率分析26
• 3. 讨论26-28
• 实验二 哈萨克羊TLR8基因SNP突变对绵羊肺腺瘤病毒侵染后细胞因子影响28-35
• 1. 材料与方法29-30
• 1.1 实验材料29
• 1.1.1 实验材料29
• 1.1.2 主要试剂29
• 1.1.3 仪器29
• 1.2 试验方法29-30
• 1.2.1 绵羊肺腺瘤病毒的制备29
• 1.2.2 攻毒实验29-30
• 1.2.3 血常规测定方法30
• 1.2.4 细胞因子的检测30
• 2. 结果30-34
• 2.1 病毒悬液的电镜观察30-31
• 2.2 血常规检测结果31-33
• 2.3 细胞因子检测结果33-34
• 3. 讨论34-35
• 实验三 人工感染绵羊肺腺瘤病毒的病理学观察35-42
• 1.材料与方法36-37
• 1.1 实验材料36
• 1.1.1 实验材料36
• 1.1.2 实验仪器与试剂36
• 1.2 实验方法36-37
• 1.2.1 剖检观察36
• 1.2.2 组织病理切片观察36-37
• 2.结果37-40
• 2.1 剖检观察37-38
• 2.2 病理组织学观察38-40
• 3.讨论40-42
• 结论42-43
• 参考文献43-51
• 致谢51-52
• 导师评阅表52

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 宋卓;;绵羊肺腺瘤病[J];畜牧兽医科技信息;2006年04期

2 张艳红;史夏云;韩惠瑛;;葛迪羊患绵羊肺腺瘤病[J];中国兽医杂志;2007年04期

3 冉双存;;绵羊肺腺瘤病研究进展[J];畜牧兽医科技信息;2010年04期

4 荆文魁;王颖;张怀宇;刘彩霞;;绵羊肺腺瘤病[J];中国兽医杂志;2010年05期

5 赵泽峗;刘淑英;罗学东;;绵羊肺腺瘤病毒的巢式RT-PCR技术检测[J];中国人兽共患病学报;2011年06期

6 张月梅;刘淑英;;内源性绵羊肺腺瘤病毒与宿主共进化研究进展[J];动物医学进展;2011年07期

7 平万军;;绵羊肺腺瘤病的流行及诊治[J];养殖技术顾问;2011年06期

8 鲁延刚;相猛;贾宁;潘虹;李栋;宁明刚;;兰州地区绵羊肺腺瘤病的诊断及病理学研究[J];甘肃农业大学学报;2012年02期

9 刘桂珍;张光涛;;绵羊肺腺瘤病的诊断与防治[J];养殖技术顾问;2013年03期

10 骆丹;路义鑫;徐义刚;付丽君;张子群;;绵羊肺腺瘤病毒实时荧光PCR检测方法的建立[J];中国预防兽医学报;2013年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 刘淑英;齐景伟;梁化春;徐萌杰;;绵羊肺腺瘤病毒的斑点杂交技术检测[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会论文集[C];2009年

2 王金良;李娇;祖立闯;沈志强;刘吉山;张文杰;;德克赛尔杂交绵羊肺腺瘤病毒病的诊断[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集[C];2010年

3 赛朝格图;徐永新;娜顺其木格;幺宏强;于立新;白善义;马学恩;;绵羊肺腺瘤病的流行病学调查和诊断[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会论文集[C];2009年

4 罗军荣;周艳喜;高华;武志红;周建华;马学恩;;绵羊肺腺瘤病血清学检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会论文集[C];2009年

5 马学恩;刘淑英;王凤龙;幺宏强;张九河;赛朝格图;白云霖;韩彩霞;张淑琴;郑秉武;;内蒙古绵羊肺腺瘤病的研究初报[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年

6 郑秉武;张淑琴;于立新;马学恩;;绵羊肺腺瘤病自然感染病例的病理学观察[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年

7 张淑琴;郑秉武;于立新;马学恩;;绵羊肺腺瘤病自然感染病例的临床病理学检查[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年

8 么宏强;马学恩;于立新;张淑琴;郑秉武;;绵羊肺腺瘤病毒人工感染羔羊后淋巴细胞的变化[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年

9 鲁延刚;贾宁;;兰州地区绵羊肺腺瘤病的诊断及病理学研究[A];2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会论文集[C];2012年

10 武志红;么宏强;于立新;马学恩;;人工感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙株羔羊的临床病理学研究[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会论文集[C];2009年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 ;羊的病毒性传染病[N];中国畜牧兽医报;2009年

中国博士学位论文全文数据库 前6条

1 周艳喜;绵羊肺腺瘤病相关基因突变的检测及绵羊、山羊内源性反转录病毒的扩增[D];内蒙古农业大学;2012年

2 罗军荣;JSRV检测及JSRV转录起始调节基因LTR致瘤机制相关性研究[D];内蒙古农业大学;2009年

3 张月梅;绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白与绵羊透明质酸酶2相互作用初探[D];内蒙古农业大学;2014年

4 斯日古楞;JSRV-NM株env基因和CA基因的克隆、表达及其单抗的制备[D];内蒙古农业大学;2007年

5 么宏强;绵羊肺腺瘤病自然病例和人工感染病例的临床病理学及分子病理学研究[D];内蒙古农业大学;2006年

6 刘淑英;绵羊肺腺瘤病毒NM株基因组全序列的研究[D];内蒙古农业大学;2004年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 赵泽峗;绵羊肺腺瘤病毒的分子生物学技术检测[D];内蒙古农业大学;2011年

2 杨素芳;新疆部分地区绵羊肺腺瘤病分子流行病学调g�、病理学诊断及全基因组分析[D];石河子大学;2015年

3 骆爽;JSRV-Env重组质粒对小鼠三种体外细胞的几种细胞生长因子表达影响的研究[D];内蒙古农业大学;2016年

4 石晶;绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白引起体内外细胞转化的研究[D];内蒙古农业大学;2016年

5 梁田;萨福克羊和哈萨克羊Toll样受体7基因SSCP多态性与绵羊肺腺瘤病的相关性分析[D];石河子大学;2016年

6 肖媛媛;新疆哈萨克羊TLR8基因突变与绵羊肺腺瘤病毒易感性关系研究[D];石河子大学;2016年

7 郑秉武;绵羊肺腺瘤病的病理组织学研究[D];内蒙古农业大学;2006年

8 刘霄卉;绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因表面蛋白的表达及其单克隆抗体的制备[D];内蒙古农业大学;2008年

9 骆丹;绵羊肺腺瘤病实时荧光定量PCR检测方法的建立[D];东北农业大学;2013年

10 武志红;人工感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙株羔羊的临床病理学研究[D];内蒙古农业大学;2009年

，

本文编号：640978