鸭FTH1基因启动子区克隆及其转录调控分析

发布时间：2017-08-29 03:33

  本文关键词：鸭FTH1基因启动子区克隆及其转录调控分析

  更多相关文章： 鸭 FTH1基因 启动子 分子克隆 转录调控

【摘要】：大量研究证实铁蛋白(FTH1)表达变化与肝炎密切相关。本课题组前期通过抑制性消减杂交技术也发现,FTH1为雏鸭肝炎病毒侵染过程中表达下调的关键候选基因,对FTH1基因编码区进行了测序分析,发现该基因的编码区在雏鸭肝炎病毒(DHV-1)感染发病、未发病和对照组不同个体间仅发现有一处同义突变,其余未发生任何有义突变、缺失或重排。为了进一步揭示鸭FTH1基因转录水平的调控机制,本研究主要开展了如下工作：1.运用基因组步移扩增,成功获得了duFTH1基因ATG上游-1110 bp,并通过在线预测5'侧翼序列含有一个典型的CpG岛,同时还发现duFTH1基因的转录起始点附近存在Sp-1等多个转录因子结合位点反式作用元件,且这些反式作用元件还位于CG二核苷酸位点上。BSP检测结果显示,鸭血液、脾脏组织中duFTH1基因启动子区的CpG岛处于低甲基化状态,且发现DHV-1病毒感染后发病、未发病和对照组血液duFTH1基因的甲基化程度均处于低甲基化状态。2.通过制备一系列启动子缺失突变体：pGL3-Basic-M1(+145～-765)、pGL3-Basic-M2 (+145～486)、pGL3-Basic-M3(+145～-265)、GL3-Basic-M4(+145～-144)、pGL3-Basic-M5 (+145～-35)、pGL3-Basic-M6(+145～-11)和pGL3-Basic-M7(+145～+50),双荧光素酶报告基因显示在表达载体pGL3-M4和pGL3-M5(-144 bp/-35 bp)之间存在重要的作用元件,对启动子活性具有影响。对DHV-1病毒感染后发病、未发病组duFTH1基因启动子转录活性区(-144 bp/-35 bp)序列进行了SNP筛查,发现在DHV-1不同处理组间仅存在1处碱基突变(-54 CT),alibaba2和jaspar软件在线预测该突变位点还影响到转录因子NRF1结合。3.为证实该SNP位点(-54 CT)的作用机制,对duFTH1基因核心启动子区可能存在的转录因子NRF1结合位点进行了定点突变,双荧光素酶报告基因显示：突变重组质粒(-54 T)荧光素酶活性极显著高于未突变重组质粒(-54 C)(P0.01)。为进一步验证该位点的作用,继续开展了凝胶电泳阻滞迁移分析(EMSA),结果显示：转录因子NRF1与duFTH1基因启动子区序列能够结合,而位点-54 CT突变明显减弱了结合条带,竞争性实验及超凝胶阻滞实验更进一步证实了结合的特异性。由上可知,duFTH1基因转录不受其启动子区甲基修饰调控,而受核心启动子区-144bp/-35 bp内的-54 CT突变影响。
【关键词】：鸭 FTH1基因 启动子 分子克隆 转录调控
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;S834
【目录】：

• 中文摘要3-4
• ABSTRACT4-8
• 符号说明8-9
• 第一章 文献综述9-17
• 1 FTH1的结构与功能9-12
• 1.1 FTH1的结构概述9-10
• 1.2 FTH1的抗氧化应激功能10-11
• 1.3 FTH1的免疫防御功能11-12
• 2 FTH1基因的转录调控研究12-14
• 2.1 真核生物启动子的顺式作用元件与反式作用因子12-13
• 2.2 FTH1基因的转录调控研究进展13-14
• 3 FTH1基因的表观遗传调控14-16
• 3.1 真核生物的表观遗传修饰14-15
• 3.2 FTH1基因表观遗传修饰研究进展15-16
• 4 本研究的目的和意义16-17
• 第二章 鸭FTH1基因启动子区克隆与DNA甲基化分析17-27
• 1 材料与方法17-23
• 1.1 材料与试剂17-18
• 1.1.1 实验动物17
• 1.1.2 实验试剂17-18
• 1.1.3 实验仪器18
• 1.2 方法18-23
• 1.2.1 基因组步移PCR扩增及测序18-20
• 1.2.2 序列分析20-21
• 1.2.3 甲基化分析21-23
• 2 结果与分析23-25
• 2.1 基因组步移PCR扩增与克隆测序23
• 2.2 鸭FTH1基因5'侧翼CpG岛预测23-24
• 2.3 鸭FTH1基因启动子甲基化检测结果24-25
• 3 讨论25-27
• 第三章 鸭FTH1基因启动子调控活性分析与转录因子鉴定27-46
• 1 材料与方法27-38
• 1.1 材料与试剂27-28
• 1.1.1 实验材料27
• 1.1.2 实验试剂27-28
• 1.1.3 实验仪器28
• 1.2 方法28-38
• 1.2.1 启动子系列缺失表达载体的构建28-30
• 1.2.2 细胞培养与瞬时转染30
• 1.2.3 启动子转录活性的检测30-31
• 1.2.4 定点突变表达载体的构建与活性检测31-32
• 1.2.5 鸭FTH1基因启动子转录活性区SNP检测与序列分析32
• 1.2.6 EMSA实验32-38
• 1.2.7 统计学处理38
• 2 结果与分析38-44
• 2.1 鸭FTH1基因启动子区系列缺失表达载体的酶切鉴定38-39
• 2.2 鸭FTH1基因启动子转录活性的检测39-40
• 2.3 鸭FTH1基因启动子转录活性区SNP检测40
• 2.4 -54C>T转录因子结合位点分析40-41
• 2.5 定点突变表达载体的构建与活性检测41-42
• 2.6 EMSA结果42-44
• 2.6.1 提取DF1细胞的核蛋白浓度42-43
• 2.6.2 EMSA凝胶迁移结果43-44
• 3 讨论44-46
• 全文结论46-47
• 参考文献47-55
• 附录55-56
• 致谢56-57
• 攻读学位期间发表的学术论文目录57-58

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本文编号：751133