绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的重组表达及初步活性鉴定

发布时间：2017-10-10 02:21

  本文关键词：绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的重组表达及初步活性鉴定

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【摘要】：目的：原核表达及纯化绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE并进行初步活性鉴定。 方法：分析绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的基因序列，设计带适当酶切位点的引物，用PCR方法扩增出FlgE的编码DNA序列，与大肠杆菌表达载体pET24a同时经NdeI/HindIII双酶切、纯化及连接后构建pET24a-FlgE原核表达质粒，，挑选重组阳性质粒经DNA测序确认序列正确，转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达条件优化，使重组质粒表达目的蛋白,采用组氨酸标签亲和层析等法对目的蛋白进行纯化，通过SDS-PAGE对纯化后蛋白分子量进行鉴定，用试剂盒进行去内毒素化处理。在体外培养人角膜上皮细胞系细胞，加入纯化的FlgE重组蛋白，培养4小时后应用实时定量PCR检测各种相关的炎性因子以反映FlgE蛋白活性。 结果：可用于大肠杆菌表达系统的重组pET24a-FlgE构建成功,其编码的蛋白在BL21中获得高效表达，当诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷浓度为1mmol/L，在16℃、225r/m振荡培养20小时时，诱导目的蛋白表达量最高，经纯化、去内毒素处理和SDS-PAGE分子量鉴定，获得纯化的重组FlgE蛋白。角膜上皮细胞用20μg/mL FlgE处理后，细胞内炎性相关分子IL-6和IL-8的表达量明显上升，而灭活的FlgE蛋白则丧失该刺激活性。 结论：获得纯化的重组绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE，且可刺激角膜上皮细胞上调炎性因子IL-6、IL-8的表达。
【关键词】：绿脓杆菌 鞭毛蛋白 FlgE 原核表达载体 角膜上皮细胞 炎性因子
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.991
【目录】：

• 研究生导师介绍5-7
• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 主要符号表10-11
• 引言11-13
• 第一章 材料和方法13-27
• 1.1 实验材料13-18
• 1.2 方法18-27
• 第二章 结果27-30
• 2.1 FlgE 基因的扩增以及表达质粒的构建27
• 2.2 重组 FlgE 的表达及纯化27-29
• 2.3 重组 FlgE 促进 HCEC 分泌炎性因子29-30
• 第三章 讨论30-32
• 参考文献32-34
• 综述34-45
• 参考文献40-45
• 攻读学位期间的研究成果45-46
• 致谢46

【共引文献】

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本文编号：1003795