脂肪干细胞向雪旺细胞诱导分化及组织工程化周围神经构建的实验研究

发布时间：2017-10-10 03:27

  本文关键词：脂肪干细胞向雪旺细胞诱导分化及组织工程化周围神经构建的实验研究

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【摘要】：目的： 1.探讨兔坐骨神经损伤后内源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)及脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的变化规律；并研究兔坐骨神经匀浆上清液对脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)的诱导分化作用。 2.探讨低渗联合冻干技术改良制备脱细胞周围神经支架的可行性,检测其理化性能。 3.探讨以改良脱细胞神经支架复合ADSCs构建组织工程化周围神经的可行性。方法： 1.采用钳夹法制作兔坐骨神经损伤模型,分别于未损伤、损伤第3天、第7天及第14天取坐骨神经制备组织匀浆,采用ELISA方法检测坐骨神经匀浆上清液中bFGF、NGF及BDNF的含量。分离、培养兔ADSCs,将第3代ADSCs分别采用各组坐骨神经匀浆上清液培养,显微镜观察细胞形态变化,7天后通过实时荧光定量PCR检测其向雪旺细胞定向分化的能力。 2.采用低渗联合冻干技术对传统脱细胞神经支架材料进行改良,脱细胞完成后采用病理HE染色、免疫荧光及扫描电镜方法对其进行组织学评估；利用Mimics软件对其孔隙率及孔隙直径进行测量；采用Endura TEC ELF3200力学仪器对其力学性能进行测试：并采用MTT法检测支架浸提液对ADSCs增殖的影响：Live/Dead染色观察细胞在支架上的活性。 3.在体式显微镜下,将第3代脂肪干细胞与改良脱细胞神经支架采用显微注射法进行复合,构建组织工程化周围神经,采用HE染色、扫描电镜观察细胞在支架上生长、存活情况。同时,将上述细胞进行PKH26标记,检测PKH26标记前后细胞生物学特性；将细胞以密度1×107个/ml接种至支架上,细胞支架复合物体外培养1周后,将其植入裸鼠背部皮下：体内培养4周后,采用小动物活体荧光成像系统检测体内细胞支架复合物荧光分布情况；处死裸鼠,取出细胞支架复合体,将其冰冻切片后,荧光显微镜下观察。 结果： 1.坐骨神经损伤后bFGF.NGF及BDNF的分泌均随损伤后时间的变化而波动,均于第3-7天达到峰值,之后下降；ADSCs体外培养呈长梭形,增殖迅速,稳定性好,经损伤坐骨神经匀浆上清液诱导后具有雪旺细胞样形态；荧光定量PCR显示：S-100蛋白基因表达量随着损伤时间的延长呈上升趋势,于损伤3天组及损伤7天组达到高峰(P0.05),之后缓慢下降。 2.HE染色及扫描电镜观察显示支架内髓鞘、细胞及轴突等结构均消失,可见平行排列的基底膜管；支架孔隙率为49.3%±9.8%,孔隙直径为(17.6+3.7)μm；支架弹性模量为2.45±0.65MPa:经MTT测定支架浸提液对细胞的增殖无影响；Live/Dead染色可见细胞在支架上生长良好。 3.PKH26能有效标记ADSCs,标记率为95.12%,MTT检测及成骨、成脂、成软骨诱导结果显示,PKH26标记对细胞增殖及多向分化潜能没有影响；细胞支架复合物裸鼠皮下培养4周后,肉眼观察在裸鼠皮下植入部位周围无感染及炎症反应,小动物活体荧光成像系统显示在支架上可见荧光分布；处死裸鼠冰冻切片后,荧光显微镜下可见红色荧光。 结论： 1.在周围神经损伤后的早期修复过程中,神经组织能够迅速调节NGF.bFGF及BDNF的分泌,各因子的分泌调节与损伤时间有关,呈峰值效应；兔损伤坐骨神经匀浆上清液在体外能够有效地诱导ADSCs分化为雪旺细胞,伤后早期(3-7天)可以作为细胞移植的最佳时间。 2.低渗联合冻干技术改良制备的脱细胞神经支架,具有良好的孔隙率及孔隙直径,良好的生物力学特性,无毒,细胞相容性良好,可作为一种更有利于细胞复合的神经支架材料。 3.以改良脱细胞神经支架复合脂肪干细胞可以初步构建组织工程化周围神经。
【关键词】：神经组织工程 支架材料 种子细胞 冷冻干燥 脂肪干细胞 PKH26
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-14
• 研究现状、成果12-13
• 研究目的、方法13-14
• 一、兔坐骨神经损伤后内源性生长因子含量的变化及意义14-21
• 1.1 对象和方法14-16
• 1.1.1 实验材料及试剂14
• 1.1.2 实验试剂配制14
• 1.1.3 实验仪器14
• 1.1.4 实验方法14-16
• 1.1.5 统计学分析16
• 1.2 结果16
• 1.2.1 兔坐骨神经损伤模型的观察16
• 1.2.2 各组中神经匀浆上清液生长因子含量的变化16
• 1.3 讨论16-18
• 1.3.1 组织匀浆与神经营养因子16-17
• 1.3.2 神经修复与神经再生17
• 1.3.3 干细胞治疗神经损伤17-18
• 1.4 小结18-19
• 附图19-21
• 二、兔坐骨神经匀浆上清液对脂肪干细胞的诱导分化作用21-32
• 2.1 对象和方法21-27
• 2.1.1 实验材料及试剂21
• 2.1.2 实验试剂配制21-22
• 2.1.3 实验仪器22-23
• 2.1.4 实验方法23-27
• 2.1.5 统计学分析27
• 2.2 结果27
• 2.2.1 ADSCs的形态学观察27
• 2.2.2 ADSCs向神经系细胞诱导时的形态变化27
• 2.2.3 实时荧光定量PCR检测结果27
• 2.3 讨论27-29
• 2.3.1 酶消化法分离提取ADSCs28
• 2.3.2 干细胞与其所处微环境的关系28-29
• 2.4 小结29-30
• 附图30-32
• 三、低渗联合冻干技术改良制备组织工程神经支架及其性能研究32-44
• 3.1 对象和方法32-36
• 3.1.1 实验材料及试剂32
• 3.1.2 实验试剂配制32
• 3.1.3 实验仪器32-33
• 3.1.4 实验方法33-35
• 3.1.5 统计学分析35-36
• 3.2 结果36
• 3.2.1 支架组织学观察36
• 3.2.2 支架Laminin免疫荧光染色36
• 3.2.3 支架扫描电镜观察36
• 3.2.4 支架生物力学性能36
• 3.2.5 支架材料细胞相容性36
• 3.3 讨论36-38
• 3.3.1 支架材料与神经组织工程37
• 3.3.2 低渗冻干改良制备脱细胞神经支架材料37
• 3.3.3 支架的理化性能及细胞相容性37-38
• 3.4 小结38-39
• 附图39-44
• 四、以改良脱细胞神经支架复合脂肪干细胞体外及裸鼠体内异位构建组织工程化周围神经的实验研究44-57
• 4.1 对象和方法44-47
• 4.1.1 实验材料及试剂44
• 4.1.2 实验试剂配制44
• 4.1.3 实验仪器44
• 4.1.4 实验方法44-47
• 4.1.5 统计学分析47
• 4.2 结果47-48
• 4.2.1 PKH26标记ADSCs结果47
• 4.2.2 组织工程化周围神经体外培养及观察47
• 4.2.3 裸鼠皮下植入实验47-48
• 4.3 讨论48-50
• 4.3.1 PKH26标记ADSCs48-49
• 4.3.2 小动物活体成像系统分析49
• 4.3.3 ADSCs与改良脱细胞神经支架在裸鼠皮下以为构建组织工程神经的可行性49-50
• 4.4 小结50-51
• 附图51-57
• 结论57-58
• 参考文献58-66
• 发表论文和参加科研情况说明66-67
• 综述67-75
• 综述参考文献72-75
• 致谢75-76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1004077