靶向调控IFITM5基因的miR-762抑制Saos-2细胞矿化的研究

发布时间：2017-10-10 05:09

  本文关键词：靶向调控IFITM5基因的miR-762抑制Saos-2细胞矿化的研究

  更多相关文章： IFITM5基因 靶基因 成骨细胞 矿化 miR-762

【摘要】：干扰素诱导跨膜蛋白5(interferon induced transmembrane protein5, IFITM5)是干扰素诱导跨膜蛋白家族成员之一，具有促进成骨细胞矿化的作用。在成骨细胞分化阶段表达量增加，尤其是骨基质形成期和矿化阶段达到峰值。Ⅴ型成骨不全患者中均发现存在IFITM5基因的5'UTR的c.-14C T突变，该类患者临床特征主要是前臂骨间膜钙化和增生性骨痂形成。 microRNA(miRNA)是一类长度21-23个核苷酸，广泛存在于多物种的内源性、非编码单链RNA，在转录后水平调控基因的表达。己证实miRNA广泛参与了多种生理病理过程，如细胞增殖、分化、凋亡。研究表明miRNA可靶向调控成骨细胞分化过程中的关键基因以调控成骨细胞的分化。但是，到目前为止，还没有生物学证据发现靶向调控成骨细胞矿化相关基因IFITM5的miRNA，从而调控成骨细胞的矿化。 目的：本研究旨在发现靶向调控IFITM5基因的microRNA，并验证microRNA对成骨细胞矿化、分化的影响。 方法：应用TargetScan、miRanda、Microcosm和DIANA-microT等4个靶标预测软件中至少两个预测结果的交集来判定microRNA和IFITM5是否存在靶标关系。人工合成microRNA mimics，并构建野生型、突变型pmirGLO-IFITM5-3'UTR双荧光素酶报告载体，通过FuGENE HD转染Saos-2细胞，检测萤火虫荧光素酶相对活性以筛选出结合于IFITM5-3'UTR的microRNA，进一步通过Western blotting检测筛选出显著下调IFITM5蛋白的microRNA。最终筛选出的microRNA转染Saos-2细胞后，诱导矿化后采用茜素红染色法观察矿化结节的形成，并应用实时荧光定量PCR检测分化标志蛋白ALP、OCN、Runx2等基因的表达。 结果：(1)生物信息学预测出28个相关microRNA，其中15个为三个及以上数据库共有。(2)通过野生型双荧光素酶报告载体与microRNA mimics共转染Saos-2细胞，以实验组荧光值相对于对照组下调30%以上为原则，筛选出miR-1296、miR-2861、miR-4316、miR-661、miR-762；构建上述五个突变型双荧光素酶报告载分别与各自microRNA mimics共转染Saos-2细胞，筛选出miR-2861、miR-4316、miR-762。(3)将上述三个microRNA转染到Saos-2细胞，Western blotting结果显示miR-762、miR-4316显著降低IFITM5蛋白表达水平。(4)茜素红染色实验发现，相对于空白对照组，在诱导矿化72h后miR-762组均抑制矿化结节的形成；实时荧光定量PCR检测矿化标志蛋白ALP、OCN、Runx2，相比于对照组，，miR-762组ALP、OCN、Runx2的mRNA表达量均下降。 结论：筛选出负向调控IFITM5的miR-762、miR-4316，并验证了miR-762抑制成骨细胞矿化的作用。
【关键词】：IFITM5基因 靶基因 成骨细胞 矿化 miR-762
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 导师简介5
• 课题组成员5-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 主要符号表12-13
• 前言13-18
• 1 IFITM5 基因13-15
• 1.1 家族成员13
• 1.2 功能及调控机制13-14
• 1.3 IFITM5 与Ⅴ型成骨不全14-15
• 2 microRNA 与成骨细胞15-18
• 2.1 microRNA 生物学起源15-16
• 2.2 靶基因的预测和验证16
• 2.3 microRNA 与成骨细胞16-18
• 第一章 靶向调控 IFITM5 基因的 microRNA 筛选18-36
• 1 材料与方法18-29
• 1.1 材料18-20
• 1.1.1 细胞18
• 1.1.2 试剂18-20
• 1.1.3 仪器20
• 1.2 方法20-29
• 1.2.1 microRNA 生物信息学预测20-21
• 1.2.2 Saos-2 细胞培养与转染21
• 1.2.3 T-IFITM5-3'UTR 重组载体的构建21-24
• 1.2.4 pmirGLO-IFITM5-W-3'UTR 重组载体的构建24-25
• 1.2.5 pmirGLO-IFITM5-Mut-3'UTR 重组载体的构建25-26
• 1.2.6 荧光素酶活性的检测26-27
• 1.2.7 Western blotting 检测 IFITM5 蛋白表达27-29
• 2 结果29-33
• 2.1 生物信息学预测结果29
• 2.2 扩增结果29-30
• 2.3 重组载体的酶切鉴定30-31
• 2.3.1 pmirGLO-IFITM5-W-3'UTR 酶切验证30
• 2.3.2 pmirGLO-IFITM5-Mut-3'UTR 酶切鉴定30-31
• 2.4 重组载体的测序鉴定31
• 2.5 荧光素酶活性的检测31-33
• 2.6 Western blotting 检测 IFITM5 蛋白表达33
• 3 讨论33-36
• 第二章 miR-762 对 Saos-2 细胞矿化的功能研究36-44
• 1 材料与方法36-40
• 1.1 材料36-37
• 1.1.1 细胞36
• 1.1.2 试剂36-37
• 1.1.3 仪器37
• 1.2 方法37-40
• 1.2.1 Saos-2 细胞培养与转染37
• 1.2.2 miR-762 定量检测37-38
• 1.2.3 茜素红染色38-39
• 1.2.4 ALP、OCN、Runx2 定量检测39-40
• 2 结果40-42
• 2.1 Saos-2 细胞转染前后 miR-762 的表达变化40-41
• 2.2 茜素红染色法检测 Saos-2 细胞的矿化程度41
• 2.3 Real-time PCR 检测各组 Runx2、ALP、OCN 的 mRNA 的表达41-42
• 3 讨论42-44
• 参考文献44-51
• 附录51-53
• 综述53-62
• 参考文献58-62
• 在校期间发表论文62-63
• 致谢63

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 莫新凯;靶向调控IFITM5基因的miR-762抑制Saos-2细胞矿化的研究[D];济南大学;2014年

本文编号：1004488