快速检测大肠杆菌和铜绿假单胞菌的传感方法的建立

发布时间：2017-10-10 19:34

  本文关键词：快速检测大肠杆菌和铜绿假单胞菌的传感方法的建立

  更多相关文章： 大肠杆菌 铜绿假单胞菌 一次性丝网印刷电极 光电型生物传感器 电流型生物传感器

【摘要】：环境、饮水、食品中的致病菌是危害人体健康的重要因素。近年来，，世界各地不同规模的食源性致病菌导致的疾病爆发事件时有发生，全球每年因食品和饮用水的细菌污染导致的死亡有上百万人。主要致病菌有大肠杆菌、副溶血弧菌、李斯特氏菌、金黄葡萄球菌、沙门氏菌等。食源性致病菌的检测对于食源性疾病预防与控制起着至关重要的作用。因此，为了有效控制食品质量、保证食品安全、避免突发性疾病以及最大程度减小社会和经济的不稳定因素，建立简便、快速、高效和成本低廉的食源性致病菌检测手段，成为目前食品现场快速检测的迫切需求。本文建立了快速检测大肠杆菌和铜绿假单胞菌的电流型和光电型两种生物传感器，对其检测性能进行了评估。原理、过程及结果概括如下： 1.检测铜绿假单胞菌的光电型生物传感方法的建立：铜绿假单胞菌可以分泌细胞色素氧化酶，能使细胞色素C氧化，而氧化型细胞色素C可以使盐酸二甲基对苯二胺氧化，产生颜色反应。该颜色反应的深浅和铜绿假单胞菌的浓度之间呈明显的线性关系。本实验根据此反应原理，设计一种便携型光电型试纸条，在该试纸条上包被盐酸二甲基对苯二胺氧化反应液，测试时将样品溶液加到试纸条的加样孔处，用自行研制的光电检测仪测定不同浓度的铜绿假单胞菌对应的反应体系光反射率的大小，绘制标准曲线，并优化反应条件，从而建立光电型生物传感方法对铜绿假单胞菌的检测。实验结果表明，用该方法检测铜绿假单胞菌的方程为：Y=1527.35714-133.96429X，相关系数为R=-0.99974(p0.01)，检测限为103CFU/mL，样品检测时间低于5分钟。该方法具有快速、简便、能实现现场检测的优点，经过进一步的改进和优化，有望在生产实践中得到应用。 2.检测大肠杆菌的光电型生物传感方法的建立：用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)对大肠杆菌进行诱导使大肠杆菌分泌β-半乳糖苷酶，将黄色的氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)加入到催化好的含有β-半乳糖苷酶的待测液中，反应生成红色的氯酚红(CPR)，反应颜色变化的深浅和大肠杆菌的浓度呈良好的对应关系。测试时，将该反应体系滴入自制的光电型试纸条中用光电型传感仪检测光反射率，反射率的高低与样品中大肠杆菌的浓度呈反比关系，由此建立检测大肠杆菌的光电型传感方法。实验结果表明，用光电传感方法检测大肠杆菌，反应体系适宜pH=7.5，酶促反应时间为4h。样品中细菌浓度的对数与反射光信号值之间呈现良好的对应关系，方程为Y=1426.10485-97.23368X，相关系数为R=-0.98944(P0.01)，检测限可达104CFU/mL，样品检测时间低于5分钟。基于颜色反应的光电传感方法检测大肠杆菌具有快速、简便、成本低廉等优点，为检测大肠杆菌提供了新思路，具有良好的进一步研发和应用前景。 3.检测大肠杆菌的电流型生物传感方法的建立：用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)对大肠杆菌进行诱导使大肠杆菌分泌β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶特异性作用于4-(2-吡啶偶氮)-邻苯三酚(PAPG)，发生氧化还原反应，产生4-氨基酚(PAP)，该氧化还原反应所产生的电流值与样品中大肠杆菌浓度呈良好的线性对应关系。因此用基于一次性丝网印刷电极的电化学生物传感器检测该反应所产生的电流，绘制相应标准曲线，从而建立了检测检测大肠杆菌的电流型生物传感方法。实验结果表明：反应体系最佳PH=7.5，酶促反应最佳时间为45min，样品中细菌浓度与电流响应值之间呈现良好的对应关系，方程为Y=1.1346×10~(-6)+1.8950×10~(-5)X，R~2=0.98943(p0.01)，最低检测限为103CFU/mL，样品检测时间低于10分钟。此方法准确性和特异性良好，应用基于酶反应体系的传感方法检测大肠杆菌具有快速、简便、灵敏的优点，适合大批量样品快速筛选。
【关键词】：大肠杆菌 铜绿假单胞菌 一次性丝网印刷电极 光电型生物传感器 电流型生物传感器
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 前言14-24
• 1 大肠埃希氏菌与铜绿假单胞菌污染现状及危害14-16
• 1.1 大肠杆菌污染现状及其危害14-15
• 1.2 铜绿假单胞菌污染现状及其危害15-16
• 2 常见致病菌检测方法的研究进展16-18
• 2.1 传统的致病菌检测方法16
• 2.2 基于免疫学的检测方法16-17
• 2.3 基于 PCR 技术的检测方法17
• 2.4 基因芯片技术在检测中的应用17-18
• 3 生物传感器在食源性致病菌检测中的应用18-22
• 3.1 生物传感器的工作原理18-19
• 3.2 生物传感器分类及在检测病原微生物中的应用19-22
• 3.2.1 电化学生物传感器在检测病原菌中的应用20-21
• 3.2.2 光电型生物传感法在检测病原菌中的应用21-22
• 4 生物传感法检测大肠杆菌和铜绿假单胞菌的理论基础22-23
• 5 本课题的研究主要内容和意义23-24
• 第二章 快速检测铜绿假单胞菌光电型传感方法的建立24-40
• 1 材料与方法24-33
• 1.1 实验材料24
• 1.2 实验方法24-33
• 1.2.1 光电型传感器的设计和工作原理24-30
• 1.2.2 光电型传感器检测铜绿假单胞菌的原理30
• 1.2.3 光电型传感器试纸条的制作30-31
• 1.2.4 反应条件的测定31-32
• 1.2.5 光电传感法检测铜绿假单胞菌标准曲线的绘制32
• 1.2.6 试纸条稳定性检测32
• 1.2.7 准确性和回收率的测定32-33
• 1.2.8 光电传感方法检测铜绿假单胞菌的效果与传统的平板法效果对比33
• 2 实验结果33-38
• 2.1 便携式光电型生物传感器研制结果33
• 2.2 光电型试纸条制备效果33-34
• 2.3 不同浓度铜绿假单胞菌反应后试纸条反射光信号值随时间变化的曲线34
• 2.4 pH 对试纸条光反射强度影响曲线34-35
• 2.5 最适盐酸二甲基对苯二胺浓度35
• 2.6 光电型传感器检测铜绿假单胞菌的标准曲线35-36
• 2.7 试纸条稳定性测试结果36
• 2.8 准确率与回收率的检测结果36-37
• 2.9 光电传感方法检测铜绿假单胞菌的效果与传统的平板法效果对比37-38
• 3 讨论38-39
• 4 结论39-40
• 第三章 快速检测食品中大肠杆菌光电型传感方法的建立40-51
• 1 材料与方法40-45
• 1.1 实验材料40-41
• 1.2 实验方法41-45
• 1.2.1 光电型传感方法检测食品中大肠杆菌的实验设计原理41
• 1.2.2 光电型传感器的检测过程41-42
• 1.2.3 大肠杆菌的筛选、培养与反应体系的组长42-43
• 1.2.4 反应条件的优化43
• 1.2.5 光电传感方法检测大肠杆菌的标准曲线绘制43-44
• 1.2.6 准确性的测定44
• 1.2.7 回收率的测定44
• 1.2.8 光电传感方法检测大肠杆菌的效果与传统的平板法效果对比44-45
• 2 实验结果45-49
• 2.1 光电试纸条制备的检测实物图45
• 2.2 不同浓度大肠杆菌反应后试纸条反射光信号值随时间变化的曲线45-46
• 2.3 不同 pH 显色反应后试纸条光反射强度变化曲线46-47
• 2.4 光电型传感器检测大肠杆菌的标准曲线47
• 2.5 准确率及回收率的检测结果47-48
• 2.6 光电传感方法检测大肠杆菌的效果与传统的平板法效果对比48-49
• 3 讨论49-50
• 4 结论50-51
• 第四章 基于β-半乳糖苷酶为生物信标的检测大肠杆菌的传感方法51-71
• 1 材料与方法51-61
• 1.1 实验材料51-52
• 1.2 实验方法52-61
• 1.2.1 电流型传感器的设计和工作原理52-56
• 1.2.2 电流型传感器检测大肠杆菌的原理56-57
• 1.2.3 大肠杆菌的培养、筛选及保存57
• 1.2.4 反应体系的组成57
• 1.2.5 传感器测试方法的建立57-59
• 1.2.6 电流型生物传感方法检测大肠杆菌的标准曲线制作59
• 1.2.7 电流型生物传感方法检测大肠杆菌的条件优化59
• 1.2.8 准确度的测定59-60
• 1.2.9 电流型生物传感方法检测大肠杆菌与平板计数法效果比较60-61
• 2 实验结果61-69
• 2.1 底物 PAPG 的电化学活性61-62
• 2.2 产物 PAP 的电化学活性扫描图及标准曲线62-63
• 2.3 电流型传感器检测大肠杆菌的扫描曲线63-65
• 2.4 电流型生物传感法检测大肠杆菌的标准曲线65
• 2.5 实验条件优化65-67
• 2.5.1 促反应时间对电极响应电流的影响65-66
• 2.5.2 支持液 pH 值对电极响应电流的影响66-67
• 2.6 实验样品检测67-68
• 2.7 准确性检测结果68-69
• 3 讨论69-70
• 4 结论70-71
• 第五章 全文总结71-73
• 参考文献73-82
• 致谢82-83
• 发表论文情况83

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杜慧心;赵迪;刘美艳;;生物传感器及其在食品检测中的应用[J];北京农业;2011年18期

2 卢智远,牛中奇,刘启,周永军,梁安慧;一种微生物检测的生物电化学方法研究[J];传感技术学报;2005年03期

3 徐璇;钟礼立;张兵;蔡瑞云;段贞;林小娟;张爱民;;荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌方法建立及价值[J];中国医师杂志;2006年12期

4 杨小兵;食品污染与食品安全控制[J];湖北预防医学杂志;2003年01期

5 舒柏华,赵志耀,徐顺清,周宜开;利用生物发光分析技术快速检测微生物的方法学研究[J];发光学报;1999年01期

6 章竹君,秦伟;光纤化学发光和生物发光传感器[J];分析科学学报;1997年01期

7 李文勇,刁伯民;国标法和纸片法对餐具大肠菌群检测比较[J];中国国境卫生检疫杂志;1994年06期

8 张淑红;吴清平;徐晓可;张菊梅;潘宝怡;彭飞艇;;桶装水中铜绿假单胞菌检测方法的比较[J];现代食品科技;2011年11期

9 张昕悦;张秀军;何聪芬;李萌;高路;;聚合酶链式反应技术检测化妆品中的铜绿假单胞菌[J];日用化学工业;2012年04期

10 冯敏,高岳,吕海燕,杨书华,万定珍,王泽港,罗时石,马飞,葛才林;ATP发光技术测定辐照前脱水蔬菜和调味品的含菌量[J];核农学报;2005年04期

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 杨平;食品中4种致病微生物的多联PCR快速检测技术研究[D];重庆大学;2007年

2 杨丽娟;基于碳纳米管修饰电极检测农药残留的酶生物传感器研究[D];吉林大学;2009年

本文编号：1008206