来源于Vero细胞的乙型脑炎灭活疫苗纯化工艺研究

发布时间：2017-10-10 18:21

  本文关键词：来源于Vero细胞的乙型脑炎灭活疫苗纯化工艺研究

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【摘要】：研究背景：国内外乙脑疫苗临床结果表明，人体对乙脑抗原本身（灭活的乙脑病毒）耐受性良好，乙脑疫苗免疫后人体产生的不良反应轻微。临床研究和临床使用过程中出现的少数严重不良反应或不良事件，已证明与抗原本身无关，而抗原外的其他成分才是免疫人群产生不良反应的主要原因。这些成分包括：病毒培养用动物细胞的残留蛋白质和残留DNA；培养基残留如小牛血清；灭活剂残留（如甲醛）；制剂添加的赋形剂（如明胶）、防腐剂（如硫柳汞）等。因此，对乙脑灭活疫苗而言，尽可能提高抗原纯度，避免在制剂中添加不合适的赋形剂、保护剂和防腐剂，制品的安全性将有可能得到进一步提高。 研究目的：国内外现有的乙脑疫苗纯化工艺，普遍采用区带离心技术路线或多步凝胶过滤技术路线。存在的最大问题是有害物质残留量过高，从而导致疫苗产品存在安全性隐患。为此，本课题对乙脑疫苗的纯化工艺进行了系统的研究,以期提高疫苗成品的纯度，减少接种副反应的发生。 研究方法：（1）灭活工艺研究：比较甲醛与β-丙内酯两种灭活剂对乙脑病毒的灭活效果；（2）浓缩工艺研究：研究不同孔径超滤膜包和不同浓缩倍数对浓缩效果的影响；（3）研究Sepharose4FF和Sephacryl S-300两种分子筛填料对乙脑病毒的纯化效果；（4）研究离子交换层析对乙脑病毒的纯化效果；（5）用优化得到的工艺路线进行了三批小试样品和三批中试样品的纯化。 研究结果：（1）β-丙内酯作为灭活剂灭活乙脑病毒有良好的回收率及更低的生产成本；（2）使用300K孔径的膜包浓缩20倍的浓缩工艺参数可以得到较高的抗原回收率及降低后期纯化的处理体积；（3）Sepharose4FF层析可以得到纯度较高的样品，，而SephacrylS-300层析样品的抗原回收率更高，在两种填料单步纯化均未达《药典》相关要求情况下，优先选择更高回收率的Sephacryl S-300作为第一步精纯；（4）经过离子交换层析后，宿主DNA残留小于10pg/剂，Vero细胞蛋白质残留量、牛血清白蛋白残留量均低于2010版药典标准10倍以上；（5）三批小试和三批中试样品得到的纯化后原液均稳定达标。 研究结论：在原有工艺中增加离子交换层析进行进一步精纯，使抗原纯度得到大幅度提升，不仅残余DNA可达10pg/剂以下，Vero细胞蛋白质残留量、牛血清白蛋白残留量均低于2010版药典标准10倍以上，也显著低于国内所有同类产品，保持了疫苗良好的免疫原性并提高了疫苗的安全性。由于乙脑病毒疫苗接种对象为少年儿童，高质量的产品必将大大降低接种人群的副反应和概率，成为父母和医护人员所欢迎的产品，能产生较高的社会效益和经济效益。
【关键词】：乙型脑炎 灭活病毒 疫苗 灭活 纯化
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 目录9-12
• 第一章 绪论12-20
• 1.1 乙型脑炎病及乙型脑炎病毒12-13
• 1.1.1 乙型脑炎病的流行及其危害12
• 1.1.2 乙型脑炎病毒的结构和生物学性质12-13
• 1.1.3 乙型脑炎流行病的预防和控制措施13
• 1.2 国内外乙脑疫苗的研发和使用情况13-17
• 1.2.1 国外乙脑疫苗的研发、生产和使用情况13-14
• 1.2.2 国内乙脑疫苗研发、生产和使用情况14-16
• 1.2.3 国内外现有疫苗存在的问题16-17
• 1.2.4 国内外乙脑疫苗的技术发展趋势17
• 1.3 本课题的立题背景17-20
• 1.3.1 现有的乙脑疫苗纯化工艺路线17-18
• 1.3.1.1 区带离心(density gradient centrifugation)17-18
• 1.3.1.2 凝胶过滤柱层析(gel filtration chromsomegraphy)18
• 1.3.2 现有乙脑疫苗纯化工艺路线存在的问题18-19
• 1.3.3 本课题的研究目的19-20
• 第二章 材料与方法20-31
• 2.1 仪器与设备20
• 2.2 材料20-22
• 2.3 方法22-31
• 2.3.1 制备方法22-23
• 2.3.1.1 培养原液的制备22
• 2.3.1.2 磷酸缓冲液的制备22
• 2.3.1.3 各种蔗糖浓度的制备22-23
• 2.3.1.4 钙镁盐水的制备23
• 2.3.1.5 补体的制备23
• 2.3.2 病毒滴度检测23-24
• 2.3.3 病毒灭活验证24
• 2.3.4 蛋白含量检测（Lowry法）24-25
• 2.3.5 抗原量检测25-26
• 2.3.6 宿主蛋白残留检测26
• 2.3.7 宿主DNA残留检测26-29
• 2.3.8 牛血清蛋白残留检测29
• 2.3.9 疫苗效力检测29-31
• 第三章 研究内容与结果31-53
• 3.1 抗原前处理工艺研究31-37
• 3.1.1 培养原液的灭活工艺研究31-36
• 3.1.1.1 甲醛灭活温度及时间的选择31-33
• 3.1.1.2 β 丙内酯灭活工艺研究33-36
• 3.1.1.3 两种灭活剂灭活效果比较36
• 3.1.2 培养原液浓缩工艺研究36-37
• 3.1.2.1 超滤膜包孔径对浓缩效果的影响36-37
• 3.1.2.2 浓缩倍数对浓缩效果的影响37
• 3.2 抗原精细纯化工艺研究37-53
• 3.2.1 凝胶过滤柱层析纯化研究37-43
• 3.2.1.1 样品上样量对Sepharose 4FF层析分离效果的影响比较37-40
• 3.2.1.2 样品上样量对S300 层析分离效果的影响比较40-42
• 3.2.1.3 两种层析填料层析效果比较42-43
• 3.2.2 离子交换柱层析纯化研究43-45
• 3.2.3 乙脑病毒灭活后抗原EIA值与动物免疫效力之间关系的研究45
• 3.2.4 小试纯化工艺研究45-48
• 3.2.5 中试纯化工艺研究48-51
• 3.2.6 与国内外同类制品的纯化技术路线比较研究51-53
• 结论53-55
• 参考文献55-58
• 致谢58-59
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果59-60
• 附件60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1007886