THAP11与ABRO1相互作用及其介导的生物学功能研究

发布时间：2017-10-12 12:09

  本文关键词：THAP11与ABRO1相互作用及其介导的生物学功能研究

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【摘要】：蛋白质相互作用是蛋白质发挥生物学功能的重要基础，研究蛋白质相互作用可以提供目标蛋白质的功能线索，还可望揭示蛋白质的分子作用机制。THAP11是THAP蛋白家族的成员之一，是一种锌离子依赖的转录因子，参与细胞凋亡、增殖调控，但其功能和作用机制还有待进一步研究。ABRO1(Abraxas Brother1)也被称为KIAA0157或者FAM175B，作为支架蛋白能够介导BRISC去泛素化酶复合体的形成，是该复合体发挥去泛素化酶催化活性所必需的成分。此外，ABRO1能与THAP5、AP-1蛋白家族结合，参与细胞氧化应激反应。目前，对ABRO1的研究还处于起步阶段，其功能和作用机制尚待深入研究。 为深入研究这两种蛋白质及其介导的生物学功能，我们以其相互作用为切入点，首先利用免疫沉淀技术，确定了THAP11与ABRO1存在相互作用，并鉴定了介导相互作用的结构域，进一步发现ABRO1在正常条件下主要分布于细胞质，少量分布于细胞核，与THAP11存在弱的共定位，但在DNA损伤时ABRO1能够入核并与THAP11形成明显的共定位。DNA损伤明显上调ABRO1和THAP11的表达，这个过程不依赖于p53。本实验室研究发现ABRO1是一种重要的DNA损伤反应调控基因（未发表结果），提示THAP11可能参与DNA损伤调控。为证明这个假设，我们检测了正常情况和DNA损伤时THAP11对细胞周期和凋亡的影响，发现过表达THAP11能促进细胞凋亡，，使细胞G2期发生阻滞，DNA损伤时，G0/G1期发生阻滞，过表达THAP11使G0/G1期阻滞更加明显。 我们实验室前期的研究发现ABRO能与p53相互作用并增强p53蛋白质的稳定性。基于THAP11能与ABRO1相互作用且参与细胞DNA损伤反应调节，我们检测了THAP11与p53的相互作用，结果发现THAP11确能与p53发生相互作用，并通过抑制p53的泛素化修饰稳定p53蛋白。双荧光素酶报告基因实验发现THAP11对p53下游靶基因MDM2和p21的转录活性有影响。 本论文通过研究THAP11和ABRO1的相互作用，揭示THAP11是一种新的p53调控分子并参与DNA损伤调节。深入研究ABRO1、p53在THAP11调控DNA损伤中的作用，及THAP11、ABRO1、p53三者的相互作用关系如是否形成蛋白质复合体将有利于揭示细胞周期调控、肿瘤发生发展等的新机制。
【关键词】：THAP11 ABRO1 p53 蛋白质相互作用 DNA损伤
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411;O629.73
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-9
• 第一章 文献综述9-21
• 1.1 THAP 蛋白9-10
• 1.2 THAP11 蛋白10-12
• 1.3 ABRO1 蛋白12-17
• 1.3.1 ABRO1 蛋白结构特点13
• 1.3.2 ABRO1 调控 BRCC36 复合体 K-63 特异性去泛素化酶活性13-14
• 1.3.3 ABRO1 参与 BRISC-SHMT 复合体调控干扰素应答14-15
• 1.3.4 ABRO1 参与细胞氧化应激反应15
• 1.3.5 ABRO1 参与抗心肌缺血15
• 1.3.6 ABRO1 调控 p53 稳定性15-16
• 1.3.7 ABRO1 与疾病16-17
• 1.4 蛋白质相互作用17-19
• 1.5 本课题研究意义19-21
• 第二章 实验材料与方法21-32
• 2.1 细胞株、菌株和质粒21
• 2.2 试剂和试剂盒21-22
• 2.3 主要设备22-24
• 2.4 常用试剂配制24-25
• 2.4.1 细菌相关溶液24
• 2.4.2 细胞培养相关溶液24
• 2.4.3 Western Blot 相关溶液24-25
• 2.4.4 细胞裂解和免疫沉淀相关溶液25
• 2.5 实验方法25-32
• 2.5.1 质粒提取25
• 2.5.2 细胞总蛋白提取25-26
• 2.5.3 哺乳动物细胞转染26
• 2.5.4 Western Blot26-27
• 2.5.5 RT-PCR27
• 2.5.6 荧光定量 PCR27
• 2.5.7 荧光素酶报告基因实验27-28
• 2.5.8 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）28
• 2.5.9 GST-pull down28
• 2.5.10 体内泛素化28-29
• 2.5.11 间接免疫荧光29
• 2.5.12 慢病毒的包装与浓缩29-30
• 2.5.13 慢病毒感染 HepG2 细胞30
• 2.5.14 细胞周期检测30
• 2.5.15 细胞凋亡检测30
• 2.5.16 生物信息学预测 p53 转录起始位点30-31
• 2.5.17 统计分析31-32
• 第三章 实验结果与讨论32-55
• 3.1 实验结果32-51
• 3.1.1 ABRO1 和 THAP11 存在外源相互作用32-33
• 3.1.2 ABRO1 与 THAP11 存在内源相互作用33
• 3.1.3 ABRO1 与 THAP11 直接相互作用33-34
• 3.1.4 ABRO1 与 THAP11 相互作用结构域的确定34-36
• 3.1.5 DNA 损伤诱导 THAP11 入核，形成与 ABRO1 的共定位36-37
• 3.1.6 DNA 损伤诱导 ABRO1 和 THAP11 蛋白水平表达上调37-38
• 3.1.7 DNA 损伤上调 ABRO1、THAP11 蛋白表达不依赖于 p5338
• 3.1.8 THAP11 慢病毒包装以及 THAP11 细胞稳定株的构建38-41
• 3.1.9 THAP11 对细胞周期的影响41-44
• 3.1.10 过表达 THAP11 促进细胞凋亡44-45
• 3.1.11 THAP11 与 p53 存在相互作用45-46
• 3.1.12 预测 THAP11 启动子区域的 p53 转录起始位点46-47
• 3.1.13 THAP11 对 p53 及其下游靶基因转录活性影响47-49
• 3.1.14 THAP11 和 p53 在蛋白水平的调控49
• 3.1.15 THAP11 能增强 p53 蛋白质稳定性49-50
• 3.1.16 THAP11 通过抑制 p53 泛素化稳定 p53 蛋白50-51
• 3.2 讨论51-55
• 第四章 结论与展望55-56
• 4.1 结论55
• 4.2 展望55-56
• 参考文献56-63
• 附录63-65
• 发表论文和参加科研情况说明65-66
• 致谢66

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1 徐婧;THAP11与ABRO1相互作用及其介导的生物学功能研究[D];天津大学;2014年

2 李扬;THAP11作为多聚谷氨酰胺疾病候选致病基因及候选抑癌基因的功能研究[D];安徽医科大学;2008年

3 杨帆;多聚谷氨酰胺疾病候选致病基因THAP11功能的初步研究[D];安徽医科大学;2009年

本文编号：1018617