维生素D受体在幽门螺杆菌感染中的作用及机制研究

发布时间：2017-10-12 13:29

  本文关键词：维生素D受体在幽门螺杆菌感染中的作用及机制研究

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【摘要】：研究背景： 维生素D是一种具有广泛生物效应的激素载体,它除了有调节钙、磷代谢,调控细胞生长发育等作用之外,同时也与免疫调节密切相关。其功能主要是通过维生素D3受体(Vitamin D receptor,VDR)来介导,VDR为亲核蛋白,属于类固醇激素／甲状腺受体超家族的成员。VDR与1,25(OH)2D3结合形成VDR/RXR,该复合物可与靶基因上游启动子区或调控区域上的特定DNA序列相结合,进而对靶基因的转录表达进行调控。 VDR参与钙离子代谢、骨骼形成、细胞生长分化、肿瘤抑制、免疫调节等各个环节,与病原微生物感染密切相关的靶基因cathelicidin antimicrobial peptides (CAMP)的活化具有密切的相关性。CAMP除了具有抗菌活性外,还具有免疫调节、抑制组织损伤、促进创伤修复等功能,是宿主防御系统的重要成分。 作为一类重要的转录因子,VDR是否对H. pylori感染具有免疫保护作用目前尚未见文献报道。目前认为VDR在抗感染免疫中起重要作用,可能与清除微生物感染和减轻组织损伤相关。进一步研究VDR对细菌感染的免疫保护效果及其诱导的炎症和免疫信号通路在抗感染过程中的作用具有重要意义。 方法： 1)收集门诊病人胃黏膜标本：胃镜下活检胃黏膜标本两份,一份送病理,一份液氮保存。 2) H. pylori感染胃黏膜上皮细胞：胃黏膜上皮细胞GES-1铺板培养24h之后,以不同的MOI值(MOI=0,10,50,100)与H. pylori共培养24h或以MOI值为100分别共培养0h,6h,12h,24h。 3) siVDR转染胃黏膜上皮细胞：转染前一天,在不包含抗生素的RPMI培养基中接种细胞,转染时细胞的汇合度要达到30～50%。应用脂质体LipofectamineTM2000作为转染试剂,以脂质体转染法将双链siRNA导入到GES-1细胞。设立阴性对照组(转染无敲低效果的VDR-negative siRNA),实验组(分别转染3对VDR siRNA)。 4) RT-qPCR检测：抽提组织或细胞Total RNA,检测RNA浓度和纯度,将RNA逆转录成cDNA,采用SYBR Green定量PCR试剂检测VDR、CAMP、IL-6、 IL-8、CYP24A、DEFB4mRNA的表达情况,以GAPDH作为内参分析基因表达水平。 5)Western-Blot检测：采用Lysis buffer抽提蛋白,应用Bradford法检测蛋白浓度,蛋白变性后上样至泳道进行SDS-PAGE电泳,然后将蛋白转移到PVDF膜上,封闭1h,一抗4℃孵育过夜,再用HRP标记的二抗孵育1h,ECL化学发光后显影、定影,最后用凝胶成像系统拍照。 6) ELISA检测：吸取12孔培养板上的培养基,5000g/min离心后,获得的上清液按照一定比例稀释,按照试剂说明书检测梯度稀释的标准品以及样本炎症因子的浓度。 7)细菌活力检测：GES-1细胞转染siVDR、siCAMP或1,25(OH)2D3干预48h,然后加MOI为100的H. pylori共培养2h,将细胞裂解倍比稀释,以500ul稀释液划线涂板,培养3-5天后菌落计数。 8)统计分析：数据统计均用均数±标准差(mean±SD)表示,用SPSS16.0统计软件包进行资料的t检验、方差分析以及Person's相关分析,P0.05表示差别具有统计学意义。 结果： 1)组织水平H. pylori感染对mRNA表达水平的影响：H. pylori感染组与正常对照组比较VDR、CAMP、IL-6、IL-8均表达上调,VDR mRNA水平与慢性炎症程度呈正相关的关系(r=0.536,P0.001),CAMP与VDR mRNA表达水平呈正相关(r=0.814,P0.001)。 2)细胞感染H. pylori对VDR、CAMP表达的影响：RT-qPCR及Western-Blot结果显示H. pylori感染组与对照组相比VDR、CAMP表达水平升高,并且具有时间和MOI值依赖性。 3)敲低VDR基因对下游基因CAMP以及炎症因子的影响：VDR敲低之后,下游基因CAMP表达水平下调,DEFB4以及CYP24A1表达下调,炎症因子IL-6、IL-8升高。 4) VDR激动剂1,25(OH)2D3在H. pylori感染中的作用：1,25(OH)2D3导致GES-1细胞炎症因子IL-6、IL-8表达下调,抗菌肽CAMP.防御素DEFB4、CYP24A1表达升高。 5) siVDR、siCAMP以及1,25(OH)2D3对H. pylori活力的影响：siVDR、siCAMP使GES-1抗菌活力下降,细胞内活菌数量增加,而1,25(OH)2D3降低活菌数量。 结论： 1)组织、细胞水平验证H. pylori感染导致VDR、CAMP、IL-6、IL-8表达上调； 2)VDR联合激动剂1,25(OH)2D3具有调控下游基因抗菌肽CAMP、防御素DEFB4及CYP24A1的作用；VDR联合激动剂1,25(OH)2D3具有调节免疫反应的作用。
【关键词】：幽门螺杆菌 维生素D受体 活性维生素D_3 抗菌肽
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-13
• 缩略语13-14
• 目次14-15
• 1 引言15-18
• 2 材料与方法18-29
• 3 结果29-40
• 4 讨论40-43
• 5 结论43-44
• 参考文献44-49
• 综述49-60
• 参考文献56-60
• 附录60-63
• 作者简历63

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本文编号：1018989