利用噬菌体展示技术制备全人抗DR5 scFv抗体

发布时间：2017-10-12 15:06

  本文关键词：利用噬菌体展示技术制备全人抗DR5 scFv抗体

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【摘要】：背景DR5是肿瘤坏死因子TNF相关的凋亡诱导的配体（TNF-relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL）的一个受体，通过它，TRAIL能诱导细胞发生凋亡。本实验室利用DR5抗原制备出能分泌抗DR5的杂交瘤细胞。该抗体为鼠单克隆抗体，但存在一些不足之处，妨限制了其在临床上的应用。随着基因工程技术的发展，利用基因工程技术制备出全人抗体，不仅克服了鼠源性的弊端，鼠单抗特异性强、均一性强的优点也被保留了下来。其中，，全人抗体和人源化抗体的制备技术包括了以下三个方面：嵌合抗体、CDR移植的抗体和展示技术与转基因技术制备的抗体，其中以噬菌体展示技术可以制备全人抗体，从根本上克服了HAMA（human anti-mouse antibody）反应，因此，噬菌体抗体库技术属于最理想的制备全人抗体人方式。 目的通过利用噬菌体展示技术来建立天然噬菌体抗体库，并从中筛选、制备全人源化抗体。 方法应用RT-PCR技术从人外周血淋巴细胞中获取人抗体可变区基因VH、VL，用重叠延伸PCR技术把连接肽基因（Gly_4Ser）3与VH和VL连接成单链抗体scFv，利用SfiI和NotⅠ酶切位点，将scFV基因连接入表达载体pcantab-5E中，电转化入大肠杆菌E.coilX-Blue中，利用噬菌体感染，建立初级噬菌体抗体库。利用菌液PCR来鉴定所建立噬菌体抗体库的插入率，挑取阳性克隆送北京金唯智生物技术公司测序，并经NCBI-Blast-Ig-Blast，来鉴定噬菌体抗体库的多样性。利用固相筛选对所建立的初级噬菌体抗体库进行四轮富集浓缩，通过ELISA筛选出抗DR5的scFV段阳性克隆。 结果成功的构建了库容量为1.01×107的天然噬菌体抗体库，经测序比对后多样性良好，并从中筛选出一株表达频率较高的克隆，和4株与抗TNF-α抗体高度同源的克隆。 结论成功的筛选出多株全人抗DR5抗体scFv，为抗体蛋白的获得打下了良好地基础。并建立起了一个天然全人抗体库的技术平台，为以后筛选针对各种毒素、病毒、病原菌等的相关抗原的抗体和获得特异性人源化抗体类药物奠定了基础。
【关键词】：噬菌体展示技术 天然噬菌体抗体库 全人抗体 DR5
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 缩略词表8-11
• 前言11-15
• 1.材料与方法15-33
• 1.1 实验材料15-17
• 1.1.1 实验试剂15-16
• 1.1.2 实验仪器16-17
• 1.2 实验方法17-33
• 1.2.1 引物设计17-21
• 1.2.2 人外周血中淋巴细胞的分离21
• 1.2.3 总 RNA 的提取21-22
• 1.2.4 cDNA 的合成22
• 1.2.5 人抗体可变区 VH、VL 基因的巢式 PCR 扩增22-24
• 1.2.6 目的基因片段的胶回收24-25
• 1.2.7 重叠延伸 PCR 进行人单链 scFv 片段的组装25-26
• 1.2.8 目的片段 scFV 与载体 pcantab-5E 的双酶切26
• 1.2.9 scFv 与 pcantab-5E 的连接26-27
• 1.2.10 XL-Blue 电转感受态的制备27
• 1.2.11 辅助噬菌体 VCSM13 的扩增27
• 1.2.12 噬菌体滴度的测定27-28
• 1.2.13 电转化建立初级噬菌体抗体库28-29
• 1.2.14 初级噬菌体库的插入率、多样性分析29
• 1.2.15 BCA 法测定 DR5 抗原浓度29-30
• 1.2.16 第一轮富集筛选30-31
• 1.2.17 制备带筛选克隆31
• 1.2.18 ELISA 筛选阳性克隆31-33
• 2.实验结果33-41
• 2.1 VH、VL 基因片段的扩增33-34
• 2.2 scFV 的扩增及纯化34-35
• 2.3 噬菌体抗体库容量的测定35
• 2.4 噬粒目的片段插入率的测定35-36
• 2.5 噬菌体抗体库多样性的测定36-37
• 2.6 BCA 测定蛋白浓度37
• 2.7 噬菌体文库的淘洗37-38
• 2.8 抗 DR5 阳性克隆的 ELISA 筛选38-41
• 3.讨论41-45
• 结论45-47
• 参考文献47-51
• 文献综述51-63
• 参考文献58-63
• 致谢63-64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：1019368