坛紫菜R-藻蓝蛋白的抗食物过敏性质研究

发布时间：2017-10-13 23:01

  本文关键词：坛紫菜R-藻蓝蛋白的抗食物过敏性质研究

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【摘要】：在过去的几十年中,食物过敏的发生率在全世界范围内有上升趋势。食物过敏常常会引起皮肤、消化道或呼吸道等部位一系列病理反应的发生,严重的还会危及到患者的生命。通过开发新型抗过敏性活性物质预防或治疗食物过敏逐渐成为一个新的研究趋势。R-藻蓝蛋白(R-phycocyanin,RPC)是存在于红藻中的一类光合色素,在光合作用过程中发挥传递光能的作用。之前研究结果显示RPC具有免疫调节的作用,但是关于RPC抗食物过敏的研究尚未见报道。探究RPC的抗食物过敏功效,并深入研究其抗食物过敏机理,对于开发新型抗过敏保健品或原料药具有重要的意义。本研究首先通过饱和硫酸铵盐析、等电点沉淀等方法完成拟穴青蟹(Scylla paramamosain)主要过敏原原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)的分离纯化,Western-blotting证实从拟穴青蟹盐溶性肌原纤维中纯化得到的38 kDa蛋白为TM。然后,通过饱和硫酸铵盐析、柱层析等方法从坛紫菜(Porphyra haitanensis)中纯化得到RPC,纯度为A620/A2806.0,紫外-可见分光光度法分析显示纯化得到的蓝色蛋白在615 nm、555 nm处有两个特征吸收峰,证明其为RPC;Native-PAGE显示为一条带,说明RPC已经高度纯化;SDS-PAGE显示RPC由α、β两个亚基组成,分子量分别为17.7 kDa、20.5 kDa。利用纯化得到的TM免疫小鼠,建立食物过敏动物模型评价RPC的抗过敏功效。动物实验结果显示,二次免疫后致敏小鼠血清中免疫球蛋白E(IgE)水平是免疫前的3倍,血清、粪便中的组胺含量分别升高到大约150 ng/mL、15μg/mg,与对照组有显著差异,证明已经建立食物过敏动物模型;另外,RPC能够显著降低小鼠血清中TM特异性IgE及血清、粪便中的组胺水平,初步确定RPC具有抗食物过敏效果。随后,利用TM混合RPC刺激小鼠脾脏淋巴细胞,检测细胞培养上清中食物过敏相关的细胞因子分泌量和胞内细胞因子基因表达量。细胞实验结果显示,TM能够显著提高TH2型淋巴细胞因子IL-13(120pg/m L)、IL-4(300 pg/mL)的蛋白分泌量和基因表达量,RPC则能够降低TH2型,但促进TH1型淋巴细胞因子的蛋白分泌量和基因表达量,并且这种调节作用具有明显的剂量反应关系。由此推断RPC是通过调节TH淋巴细胞由TH2型向TH1型转化发挥抗食物过敏作用效果。研究还发现RPC能够诱导产生大量IFN-γ(1600 pg/mL),较其它细胞因子作用效果显著。因此,我们进一步利用磷酸激酶抑制剂探究RPC诱导IFN-γ产生的信号通路途径。结果显示,由RPC诱导产生IFN-γ是通过JAK2和JNK信号途径。综上所述,从坛紫菜中提取得到的高纯度RPC能够降低血清特异性IgE及组胺水平,并通过调节TH细胞向TH1型转化发挥抗食物过敏功效;RPC通过JAK2和JNK两条途径诱导产生TH1型淋巴细胞因子IFN-γ。
【关键词】：原肌球蛋白 食物过敏 小鼠模型 坛紫菜 R-藻蓝蛋白 抗过敏活性 TH细胞极化
【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：Q946;R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 主要符号表11-12
• 第1章 引言12-21
• 1.1 食物过敏和食物过敏原12-13
• 1.2 食物过敏机理13-17
• 1.2.1 TH_1型免疫细胞因子IFN-γ14
• 1.2.2 TH_2型免疫细胞因子IL-4、IL-13和IL-514-15
• 1.2.3 其它免疫细胞因子及转录因子15-16
• 1.2.4 TH淋巴细胞的极化16-17
• 1.4 食物过敏的治疗17-18
• 1.4.1 抗原特异性治疗17-18
• 1.4.2 非抗原特异性治疗18
• 1.5 抗过敏的活性物质18-20
• 1.5.1 益生菌和中草药18
• 1.5.2 海藻中抗过敏的活性物质18-20
• 1.6 本研究的目的和意义20-21
• 第2章 材料与方法21-34
• 2.1 材料21-25
• 2.1.1 原料21
• 2.1.2 试剂21-22
• 2.1.3 实验所用主要溶液及配制方法22-24
• 2.1.4 主要仪器设备24-25
• 2.2 实验方法25-34
• 2.2.1 拟穴青蟹TM的纯化与鉴定25-27
• 2.2.2 坛紫菜RPC的纯化、鉴定与光谱性质分析27-28
• 2.2.3 食物过敏的BALB/c小鼠模型建立28-29
• 2.2.4 小鼠腹腔灌洗液的制备及细胞因子检测29-30
• 2.2.5 小鼠脾脏淋巴细胞培养及细胞因子检测30-32
• 2.2.6 RPC诱导IFN-γ产生的胞内信号途径分析32-33
• 2.2.7 统计分析33-34
• 第3章 结果与分析34-55
• 3.1 TM的纯化与鉴定34-35
• 3.1.1 TM的纯化34
• 3.1.2 TM的鉴定34-35
• 3.2 RPC的纯化、鉴定与光谱稳定性分析35-38
• 3.2.1 RPC的纯化35-36
• 3.2.2 RPC的鉴定36-37
• 3.2.3 RPC的光谱稳定性分析37-38
• 3.3 小鼠体内试验评价RPC抗食物过敏的效果38-42
• 3.3.1 小鼠的症状分析38
• 3.3.2 RPC对小鼠血清特异性IgE水平及组胺含量的影响38-42
• 3.3.3 小鼠空肠组织病理学分析42
• 3.4 RPC对淋巴细胞活力及胞内因子表达量的影响42-53
• 3.4.1 RPC对淋巴细胞活力的影响42-43
• 3.4.2 RPC对小鼠腹腔灌洗液中细胞因子的调节作用43-46
• 3.4.3 RPC对细胞因子蛋白水平的调节作用46-48
• 3.4.4 RPC对细胞因子基因水平的调节作用48-50
• 3.4.5 RPC对其它细胞因子及转录因子基因水平的调节作用50-53
• 3.5 RPC诱导产生高水平IFN-γ的作用机制53-55
• 3.5.1 RPC与TM的协同作用53-54
• 3.5.2 RPC通过JAK2及JNK途径诱导产生IFN-γ54-55
• 第4章 讨论与结论55-59
• 4.1 RPC的纯化及光谱稳定性分析55-56
• 4.2 RPC对TM特异性IgE水平及组胺含量的调节作用56-57
• 4.3 RPC对空肠组织过敏性炎症的消除作用57
• 4.4 RPC对食物过敏相关细胞因子及转录因子的调节作用57-58
• 4.5 与RPC诱导产生IFN-γ相关的胞内信号途径58
• 4.6 结论与展望58-59
• 致谢59-60
• 参考文献60-69
• 附录69-73
• 在学期间发表的学术论文及专利73

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本文编号：1027549