结核亚单位疫苗EAMMB的构建及表达纯化

发布时间：2017-10-14 14:06

  本文关键词：结核亚单位疫苗EAMMB的构建及表达纯化

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【摘要】：目的：构建不带标签的结核分枝杆菌重组融合蛋白ESAT-6-Ag85B-MPT64(190-198)-MTB8.4-HBHA(31-199)(EAMMB)原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中进行原核表达。对表达的蛋白进行纯化,获得融合蛋白EAMMB,用于结核亚单位疫苗抗原筛选。 方法：以BCG基因组为模板,用PCR扩增HBHA蛋白基因序列(含Sad和HindⅢ位点),并和本实验室已有的质粒pET30a-EAMM同时进行SacI和(?)indⅢ双酶切,酶切后的PCR产物和质粒pET30a-EAMM连接,构建重组质粒pET30a-EAMMB,并通过DH5a大量扩增重组质粒后,将质粒导入表达菌BL21(DE3)中。以诱导温度37℃,诱导时间6h,诱导剂IPTG终浓度O.1mmol/L时,最佳条件诱导目的蛋白表达。并对表达蛋白的菌液,通过收集,破碎,离心,重悬菌体,洗涤等方法获得粗纯的蛋白,并用弱阴离子柱对目的蛋白进行纯化。 结果：获得具有一定纯度EAMMB蛋白,分子量预测在56000附近,经SDS-PAGE蛋白电泳验证与预测值一致。 结论：融合蛋白EAMMB的成功表达及纯化,为进一步研究结核亚单位疫苗提供新的候选疫苗。
【关键词】：结核分枝杆菌 亚单位疫苗 EAMMB HBHA
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• ~.略词表8-9
• 前言9-12
• 1. 材料和方法12-27
• 1.1 材料12-16
• 1.1.1 材料12
• 1.1.2 仪器设备12-13
• 1.1.3 引物设计与合成13
• 1.1.4 主要试剂及配方13-16
• 1.2 方法16-27
• 1.2.1 技术路线16-17
• 1.2.2 BCG DNA基因组提取17
• 1.2.3 目的基因的扩增17-18
• 1.2.4 质粒提取18
• 1.2.5 质粒和PCR产物双酶切鉴定及纯化18-20
• 1.2.6 连接体系的建立20
• 1.2.7 转化20-21
• 1.2.8 菌落PCR验证及双酶切验证21
• 1.2.9 BL21(DE3)转化21-22
• 1.2.10 蛋白表达及可溶性分析22-23
• 1.2.11 融合蛋白EAMMB纯化23-25
• 1.2.12 蛋白HBHAd纯化25
• 1.2.13 蛋白浓度测定25-27
• 2. 结果27-34
• 2.1 hbha基因的扩增27
• 2.2 质粒pET30a-EAMM提取和酶切27-28
• 2.3 质粒pET30a-EAMMB双酶切图28
• 2.4 质粒pET30a提取和酶切28
• 2.5 质粒pET30a-HBHAd双酶切图28-29
• 2.6 测序结果图29-30
• 2.7 融合蛋白EAMMB表达条件摸索30-31
• 2.8 融合蛋白EAMMB纯化条件摸索31-32
• 2.8.1 洗涤次数的摸索31-32
• 2.8.2 硫酸铵沉淀条件摸索32
• 2.8.3 EAMMB纯化结果32
• 2.9 带His标签蛋白HBHAd纯化32-34
• 2.9.1 咪唑洗脱浓度的摸索32-33
• 2.9.2 带标签蛋白HBHAd纯化结果33-34
• 3. 讨论与结论34-36
• 3.1 讨论34-35
• 3.2 结论35-36
• 参考文献36-39
• 综述39-45
• 摘要39
• 1. 我国结核病现状39
• 2. HBHA蛋白特性39-41
• 2.1 蛋白结构特点39-40
• 2.2 分布特性40
• 2.3 免疫学特性40-41
• 3. HBHA在疫苗研制和结核病诊断中的研究进展41
• 4. 展望41-43
• 参考文献43-45
• 在学期间研究成果45-46
• 致谢46

【共引文献】

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1 Koussougbo Ouma Devi（乌玛）;T-SPOT.TB在评估系统性自身免疫病合并结核病患者中的作用研究[D];中南大学;2012年

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本文编号：1031461