细胞因子白介素IL-21分子动力学与生物活性关系研究

发布时间：2017-10-14 23:11

  本文关键词：细胞因子白介素IL-21分子动力学与生物活性关系研究

  更多相关文章： 白细胞介素21 复性 核磁共振 主链归属 分子动力学

【摘要】：白细胞介素IL-21由激活的CD4+T细胞、滤泡辅助性T细胞以及自然杀伤T细胞分泌,在先天性免疫以及适应性免疫反应中发挥出多重效果,其生物学活性则由IL-21与其同源的受体复合物结合从而被激活。最新研究得到IL-21的突变体将人hIL-21CD loop上的氨基酸用IL-4螺旋C上更稳定的氨基酸替换,之后激活受体的生物学活性增强十倍。生物活性的基础在于蛋白质在溶液中的动态行为,因此对蛋白质在体内动力学变化过程的研究,能够帮助我们揭示其作用机理。而核磁共振(NMR)技术可以提供分子动力学与分子间相互作用的信息,因此本论文首先通过优化复性方法得到具有生物学活性的蛋白质溶液,之后利用核磁共振技术归属突变体蛋白hIL-21/hIL-4的主链信号,并进行蛋白质分子动力学的弛豫分散实验,主要内容如下： 1.重组蛋白在大肠杆菌(E. coli)中表达时大部分以包涵体形式存在,为了得到活性蛋白质溶液,成功复性很关键。而传统的分步透析复性常使中间态存在时间过长,蛋白易聚集。采用优化后的两步稀释透析复性,显著提高了透析效率与蛋白产量。之后采集mIL-21蛋白在磷酸盐buffer(pH8.5)中的一维氢谱,结果显示蛋白质在溶液中形成正确的三级结构并具有生物活性,对后续主链归属奠定了较好的基础。 2.在优化的复性条件基础之上,得到了15N、13C同位素双标记的重组嵌合蛋白hIL-21/hIL-4,运用液体高分辨核磁共振技术采集了二维15N-HSQC谱以及三共振谱,对嵌合蛋白的大部分主链信号进行了归属及解析。 3.通过15N弛豫来研究蛋白质动力学。进行了R2弛豫分散实验,在射频场强改变的条件下,采集一系列15N-HSQC谱,对不同弛豫速率R2用三种运动模型进行曲线拟合,拟合结果显示与hIL-21相比hIL-21/hIL-4嵌合蛋白分子在溶液中的动态行为发生了变化,使螺旋C与CD loop区变得更加稳定,有利于增强其激活受体传导信号的生物学功能。
【关键词】：白细胞介素21 复性 核磁共振 主链归属 分子动力学
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392;O657.2
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第一章 绪论9-19
• 1.1 研究背景9-10
• 1.2 选题思想10-11
• 1.3 包涵体蛋白及复性技术11-14
• 1.3.1 包涵体的形成及溶解11-12
• 1.3.2 包涵体的复性12-14
• 1.4 核磁共振技术14-16
• 1.4.1 核磁共振在蛋白质溶液结构中的应用14
• 1.4.2 同位素标记的三共振实验概述14-16
• 1.5 蛋白质分子动力学的NMR研究16-19
• 1.5.1 蛋白质动力学概述16-17
• 1.5.2 R_2弛豫分散实验17-19
• 第二章 蛋白复性条件的优化19-37
• 2.1 引言19
• 2.2 实验材料19-26
• 2.2.1 质粒和菌株19
• 2.2.2 试剂和仪器19-21
• 2.2.3 实验流程图21
• 2.2.4 溶液的配制21-26
• 2.3 实验部分26-30
• 2.3.1 mIL-21重组蛋白的表达和包涵体的溶解26-27
• 2.3.2 蛋白纯化和复性条件的优化27-30
• 2.4 结果与讨论30-36
• 2.4.1 mIL-21重组蛋白的表达及SDS-PAGE胶的分析30-32
• 2.4.2 纯化及复性结果分析32-35
• 2.4.3 一维氢谱分析35-36
• 2.5 本章小结36-37
• 第三章 hIL-21/hIL-4嵌合蛋白蛋白质主链信号的归属37-49
• 3.1 引言37
• 3.2 实验材料37-40
• 3.2.1 质粒和菌株37-38
• 3.2.2 试剂和仪器38
• 3.2.3 溶液的配制38-40
• 3.3 实验部分40-42
• 3.3.1 hIL-21/hIL-4重组蛋白的表达40-41
• 3.3.2 hIL-21/hIL-4嵌合蛋白的纯化及透析复性41-42
• 3.3.3 核磁共振所用标记蛋白的表达和纯化复性42
• 3.4 结果与讨论42-48
• 3.4.1 hIL-21/hIL-4嵌合蛋白的表达及SDS-PAGE胶的分析42-44
• 3.4.2 纯化及复性结果分析44-45
• 3.4.3 核磁信号归属45-48
• 3.5 本章小节48-49
• 第四章 hIL-21/hIL-4嵌合蛋白分子动力学研究49-55
• 4.1 引言49
• 4.2 实验部分49-50
• 4.2.1 NMR实验样品制备49-50
• 4.2.2 NMR实验50
• 4.3 结果与讨论50-54
• 4.3.1 构象化学交换快慢的分析50-51
• 4.3.2 R_2弛豫分散实验结果分析51-54
• 4.4 小结与展望54-55
• 参考文献55-61
• 致谢61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 廖新丽,林东海;用异核多维NMR技术研究蛋白质动力学[J];波谱学杂志;2004年04期

2 宣劲松;王金凤;;核磁共振研究中蛋白质样品的同位素标记策略[J];波谱学杂志;2008年03期

3 胡蕴菲;金长文;;蛋白质溶液结构及动力学的核磁共振研究[J];波谱学杂志;2009年02期

4 文yN;林东海;;基于NMR自旋弛豫技术的蛋白质动力学研究[J];波谱学杂志;2012年02期

5 方敏,黄华j;包涵体蛋白体外复性的研究进展[J];生物工程学报;2001年06期

6 王增;马会勤;张文;陈尚武;;包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展[J];中国生物工程杂志;2009年07期

7 田永菊;崔保霞;;白细胞介素21抗肿瘤作用的研究进展[J];肿瘤;2010年03期

，

本文编号：1033706