白血病小鼠微移植模型建立及其相关机制初步研究

发布时间：2017-10-16 02:35

  本文关键词：白血病小鼠微移植模型建立及其相关机制初步研究

  更多相关文章： WEHI-3细胞 白血病小鼠 微移植 H-2全不相合 微嵌合 移植物抗白血病效应 移植物抗宿主病

【摘要】：目的建立白血病小鼠H-2全不相合微移植模型并进行鉴定，通过此模型验证微移植具有促造血、抗白血病等作用，同时避免移植物抗宿主病，并初步探讨与上述作用相关的机制。 内容1、建立小鼠白血病模型根据本研究室已成熟的方法及参考相关文献建立小鼠急性粒单核细胞（M4）白血病模型并鉴定；2、白血病小鼠化疗方案的优化采用不同的MA(米托蒽醌+阿糖胞苷)化疗方案，通过比较早期死亡率、骨髓抑制等指标来选择微移植中的化疗方案；3、回输供体动员的脾细胞量的优化及微移植模型的鉴定回输不同的供体动员后脾细胞，通过比较早期死亡率、促白细胞恢复及相同时间点白血病负荷等，选择微移植中合适的供体细胞量。微移植模型建立后在供体嵌合及GVHD两方面对模型进行鉴定；4、微移植促造血、抗白血病效应同时避免GVHD机制的初步研究通过观察白血病小鼠微移植后一般情况、供体嵌合体变化规律、造血恢复情况、白血病负荷变化、细胞因子及骨髓、肝、脾及肠道病理变化等初步研究探讨微移植发挥上述作用的相关机制。 方法受鼠为雌性BALB/c小鼠(H2Kd/d)，供鼠为雄性C57小鼠(H2Kb/b)，供受体H-2全不相合。首先建立小鼠白血病模型，雌性BALB/c小鼠随机分成2组(n=10)，白血病模型组和正常对照组,白血病模型组小鼠经尾静脉接种约1×106个WEHI-3细胞（小鼠急性髓系白血病M4细胞株），正常对照组接种等量生理盐水。从外周血涂片、骨髓形态学、免疫组化、免疫表型及病理组织学等方面诊断发病情况，并记录死亡情况。其次进行MA化疗方案的优化（n=8），受鼠接种1×106/个WEHI-3细胞后，随机分成3组(米托蒽醌2mg/kg×1d+阿糖胞苷200mg/kg×3d、米托蒽醌4mg/kg×1d+阿糖胞苷200mg/kg×3d、米托蒽醌8mg/kg×1d+阿糖胞苷200mg/kg×3d)，通过早期死亡率及骨髓抑制情况选取合适化疗方案。然后进行回输供体细胞量的优化，供鼠自微移植-5天开始接受皮下rhG-CSF（100μg/kg）的动员，q12h×5d,末次动员12小时后进行脾单个核细胞的提取。接种白血病细胞的受鼠化疗后给予回输不同数量的经动员后的供体脾单个核细胞，细胞量分别为（3、6、12）×107个（n=12），比较各组早期死亡率、促白细胞恢复及白血病负荷情况，来选择合适的供体细胞量。微移植模型建立后从供体嵌合率、GVHD发生情况量方面对模型进行鉴定。最后比较微移植组和单纯化疗对照组的早期死亡率、促造血恢复、相同时间点的白血病负荷、生存情况等，以验证微移植的疗效。对细胞因子、供体嵌合等进行检测，，初步研究微移植发挥相关作用的机制。 结果小鼠白血病模型建立：白血病模型组小鼠在2周之内全部发病,骨髓中原始细胞比例占NEC（非红有核计数）的30%以上，生存期为17-35天。接种后第3周，白血病模型组小鼠外周血白细胞最高可达85.09×109/L，与正常对照组小鼠差异有统计学意义(P0.05)。骨髓细胞免疫组化提示POX（+）、CE（+）、NSE（+）、NaF（-）。发病小鼠各器官中可见大量白血病细胞浸润。结果与本实验室及相关文献结果一致，说明此白血病模型较为稳定。化疗方案优化：3组化疗方案(①M2mg/kg×1d+A200mg/kg×3d、②M4mg/kg×1d+A200mg/kg×3d、③M8mg/kg×1d+A200mg/kg×3d)早期死亡率分别为0、25%、100%，①②死亡差异无统计学意义（P0.05），①②与③死亡率差异显著（P0.01）；在骨髓抑制方面，②比①停化疗第1-4天白细胞低，差异具有统计学意义（P0.05），综合死亡率和骨髓抑制结果选取②MA(M4mg/kg×1d+A200mg/kg×3d)作为化疗方案。回输细胞量选择方面：早期死亡率，化疗对照组为25%，（3、6、12）×107组分别为16.67%、8.33%、8.33%，四组之间差异无统计学意义（P0.05）；白细胞恢复情况，（3、6）×107组明显优于12×107组，差异有统计学意义（P0.05）；白血病负荷检测结果显示(3、6、12)×107组较化疗对照组负荷低，有显著性差异（P0.01），(6、12)×107较3×107组低，差异有统计学意义（P0.05），6×107与12×107差异无统计学意义（P0.05）。综合早期死亡率、促白细胞恢复和白血病负荷结果选取6×107作为回输的供体细胞量，后续的实验以此细胞量为标准。微移植模型鉴定：微移植后供体成分可在回输供体细胞后2周之内检测到，是以微嵌合形式存在。通过与单纯化疗组小鼠比较，微移植组小鼠在临床表现及病理方面均未发现明显GVHD证据。微移植促造血作用、抗白血病效应同时避免GVHD观察及机制初步研究：微移植组早期死亡率明显降低，白细胞恢复情况较化疗组有优势，发病时间较化疗组延迟2周左右。微移植后供体微嵌合在回输后2周之内可检测到；细胞因子检测发现微移植后2周特别是1周之内细胞因子升高最为明显，其中IL-2、IL-6、TNF、IFN在微移植组和化疗对照组之间差异最明显。 结论成功建立了小鼠白血病模型，选取了（M4mg/kg×1d+A200mg/kg×3d）作为微移植化疗方案，并选取6×107作为回输的供体细胞量，从供体嵌合和GVHD方面对微移植模型进行了鉴定，成功建立了微移植模型。通过白血病小鼠微移植模型建立及组织病理学和细胞因子等相关指标的检测，推测微移植促造血作用可能与输注大量异基因造血细胞对受者造血组织的保护作用以及对白血病细胞快速清除并促进体内参与造血的细胞因子如IL-6等浓度升高有关，微移植发挥抗白血病效应可能与供体微嵌合状态、微移植后细胞因子如IL-2、IFN、TNF升高等变化有关。微移植避免GVHD发生可能与微移植理念有关。该白血病小鼠H-2全不相合微移植模型的建立及相关研究为微移植动物及临床研究提供了基础。
【关键词】：WEHI-3细胞 白血病小鼠 微移植 H-2全不相合 微嵌合 移植物抗白血病效应 移植物抗宿主病
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R733.7;R-332
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 第一部分 小鼠白血病模型的建立及鉴定15-21
• 材料方法15-17
• 结果17-19
• 讨论19-20
• 小结20-21
• 第二部分 化疗方案的优化21-24
• 材料方法21-22
• 结果22-23
• 讨论23
• 小结23-24
• 第三部分 回输供体细胞量的优化及微移植模型的鉴定24-34
• 材料方法24-28
• 结果28-32
• 讨论32-33
• 小结33-34
• 第四部分 微移植发挥抗白血病效应同时避免移植物抗宿主病相关机制的初步研究34-44
• 材料方法35-36
• 结果36-40
• 讨论40-42
• 小结42-44
• 参考文献44-49
• 综述 移植物抗白血病效应和移植物抗宿主病分离策略的研究进展49-58
• 参考文献53-58
• 论著 白血病小鼠 H2 全不相合微移植模型的建立及鉴定58-68
• 参考文献66-68
• 个人简历68-69
• 致谢69

【参考文献】

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1 陈龙邦;;抗肿瘤化疗与抗肿瘤免疫[J];医学研究生学报;2008年02期

本文编号：1040150