成骨细胞中持续激活β-catenin对小鼠骨量和骨生长的调控作用及机制研究

发布时间：2017-10-16 06:02

  本文关键词：成骨细胞中持续激活β-catenin对小鼠骨量和骨生长的调控作用及机制研究

  更多相关文章： Wnt/β-catenin通路 骨量 骨生长

【摘要】：研究背景和目的： 骨质疏松是以骨量减少、骨的显微结构受损、骨脆性增加，从而导致骨折危险性升高为特征的疾病，其发病率随年龄增加而升高，严重威胁人类健康，其防治对提高人民生活质量和减轻社会及家庭经济负担意义重大。目前，治疗骨质疏松的常用药物有双磷酸盐、降钙素、甲状旁腺素等。各种药物均显示了一定的疗效，但容易引起脏器功能障碍和继发性骨形成减少等副作用[1]。 Wnt/β-catenin信号通路被证实在调控骨量中具有重要作用，，新近发现，针对这个通路研制出的药物比其他药物具有增加骨量更明显的优点，显示了良好的临床应用前景。但其安全性能尚未得到充分证实，其作用机制尚存在很多争议[2]。骨形成和骨吸收二者之间的平衡决定骨的总量：成骨细胞分泌骨基质，增加骨量；而破骨细胞进行骨吸收，两者协同作用调控骨量。目前大量的研究证实Wnt/-catenin信号通路在调控骨量中具有重要作用：条件敲除β-catenin或Wnt辅受体Lrp6/Lrp5后，小鼠骨量明显下降；相反，在成骨细胞中持续激活β-Catentin可显著增加骨量。但激活Wnt/β-Catentin信号通路活增加骨量的机制尚不明了，对成骨和破骨的作用效应尚存很大的争议：Holmen和Kramer等人认为β-catentin主要通过调节破骨细胞数量和功能调控骨量，而对成骨形成没有影响[3,4]；Cawthorn和Riddle等人认为Wnt/β-Catentin主要通过促进骨形成增加骨量，对骨吸收没有明显影响[5,6]；而Chen等人证实β-Catentin同时通过调节骨形成和骨吸收来控制骨量[7]。 本研究中，我们以Catnb+/lox(exon3)小鼠和3.2kb pro-collagen I Cre-ERTM小鼠杂交，通过在出生后不同时期注射他莫昔芬（Tamoxifen，TM）在成骨细胞中持续激活β-catenin，观察不同时期激活β-catenin后对小鼠骨量和骨生长的影响，并初步探讨其机制。 实验方法： 第一部分：成骨细胞中持续激活β-catenin对小鼠骨量的调控作用及机制 将Catnb+/lox(exon3)小鼠和3.2kb pro-collagen I Cre-ERTM小鼠杂交，基因型鉴定筛选CA-β-catenin小鼠作为实验鼠，而同窝野生组小鼠作为对照小鼠。在出生后第3日，2、4、5、7月等时相点注射TM，持续1月，以持续激活β-catenin。 1．观察小鼠外形，测量小鼠身长等大体指标； 2．X线片和Micro-CT检测小鼠出生后不同时期腰椎、胫骨骨密度、骨量和骨组织结构的变化； 3．HE染色和Safranin O染色观察小鼠脊椎和长骨显微形态学变化； 4．TRAP染色破骨细胞数量； 5．免疫组织化学染色观察成骨细胞分化、破骨细胞、骨形成、骨吸收等相关标记物的表达变化情况,包括骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein, BSP)，Runx2转录因子（runt-related transcription factor2，Runx2），组织非特异性碱性磷酸酶（nonspecificalkaline phosphatase，TNAP）； 6．定量PCR检测成骨细胞分化、破骨细胞、骨形成、骨吸收等相关标记物的表达变化情况，包括TNAP，Runx2，BSP，抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate ResistantAcidPhosphatase，TRAP），核因子κB受体活化因子配体（Receptor Activator for NuclearFactor-κ B Ligand，RANKL）：骨保护蛋白（osteoprotegerin，OPG）比值； 7．ELISA检测骨形成和骨吸收相关标记物，包括Ⅰ型胶原蛋白氨基端前胶原肽（N-terminal peptide of type Ⅰ procollagen， PINP），骨钙素（osteocalcin，OC），Ⅰ型胶原交联c端肽（C-terminal telopeptide of type I collagen，CTX-I）和抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate resistant acid phosphatase5b，TRAcP5b）。 第二部分：成骨细胞中持续激活β-catenin对小鼠骨生长的影响及可能机制 1．小鼠模型同上; 2．X线片检测小鼠出生后不同时期小鼠身长的变化; 3. HE染色和Safranin O染色观察小鼠脊椎和长骨生长板变化情况; 4．收集小鼠血清，测量血磷、血钙等的水平; 5．免疫组织化学检测骨生长相关因子FGF23（Fibroblast growth factor23，FGF23）等的变化情况; 6．TUNEL法检测椎体生长板软骨细胞凋亡。 实验结果： 1．从早期（3天）和晚期（2、4、5、7月）持续激活β-catenin均可增加松质骨骨量。Micro-CT显示，早期激活时，小鼠脊椎松质骨骨量增加可达300%，但增加的骨量靠近生长板一侧；而从2、4、5、7月开始激活，小鼠松质骨骨量增加也可达到180—200%，增加的骨量分布整个椎体; 2．从早期（3天）和晚期（2、4、5、7月）持续激活β-catenin后成骨细胞分化标记物RUNX2、BSP表达上调，骨形成标记物TNAP表达增加；同时，破骨细胞标记物RANKL、TRAP表达下调。ELISA提示血清PINP、OC浓度升高，CTX-I、TRAcP5b浓度降低。这些共同提示骨形成增加，骨吸收减少; 3．早期开始激活β-catenin虽然可以增加骨量，但小鼠发育受到影响，表现为体型变小、长骨和椎体变短。HE染色和Safranin O染色显示小鼠生长板变长，尤其是肥大层细胞明显增多，凋亡减少。而晚期激活β-catenin后骨生长未受明显影响; 4．早期持续激活β-catenin，小鼠血磷水平降低，血钙水平无明显变化，FGF23表达上调，这可能是小鼠骨生长受阻的原因。晚期血磷水平降低，血钙水平和FGF23表达未见差异。 结论： 从早期（3天）和晚期（2、4、5、7月）持续激活β-catenin均可增加松质骨骨量。骨形成增加和骨吸收减少共同作用引起骨量增加。但在早期激活后会导致骨生长受阻，其可能机制是低血磷和FGF23的表达上调阻碍了生长板发育。
【关键词】：Wnt/β-catenin通路 骨量 骨生长
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R336
【目录】：

• 缩略语表4-6
• Abstract6-10
• 中文摘要10-13
• 前言13-15
• 第一章 成骨细胞中持续激活β-catenin 对小鼠骨量的调控作用及机制15-37
• 1.1 引言15
• 1.2 材料与方法15-22
• 1.3 结果22-34
• 1.4 讨论34-37
• 第二章 成骨细胞中持续激活β-catenin 对小鼠骨生长的影响及可能机制37-46
• 2.1 引言37
• 2.2 材料与方法37-39
• 2.3 结果39-44
• 2.4 讨论44-46
• 全文结论46-47
• 参考文献47-50
• 文献综述 Wnt/β-catenin 信号通路对骨量的影响50-66
• 参考文献62-66
• 攻读硕士学位期间发表的论文66-67
• 致谢67

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本文编号：1041007