HECT类泛素连接酶NEDL2与细胞周期的相关性研究

发布时间：2017-10-17 12:14

  本文关键词：HECT类泛素连接酶NEDL2与细胞周期的相关性研究

  更多相关文章： 蛋白质泛素化 泛素连接酶 NEDL2 细胞周期调控 APC/C-Cdh1

【摘要】：真核细胞内蛋白质降解途径主要是溶酶体降解途径和泛素-蛋白酶体途径，其中后者通过选择性清除细胞内错误折叠以及特定环境下需要降解的蛋白质，对维持细胞正常的生理功能发挥至关重要的作用，其异常与炎症、癌症及神经退行性疾病等密切相关。蛋白泛素化修饰在泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）及泛素连接酶（E3）的顺序作用下介导酶促级联反应完成，最后经蛋白酶体降解，其中E3决定底物识别的特异性，是蛋白质泛素化领域的研究热点，按结构特点与作用机制主要分为两大类：RING锌指类和HECT结构域类。 RING类E3复合体APC/C（后期促进复合体）主要在细胞周期调控中发挥功能，它由恒定原件APC2，APC11和其它11个亚基组成。Cdc20和Cdh1是APC/C的激活因子，与底物的特异性相关，它们通过协助不同周期进程的APC/C复合体募集底物而维持细胞周期正常进行。其中Cdh1通过识别包含D box或者KEN box的底物在细胞退出M期的过程中和G1期中发挥功能。 人们对HECT类E3的功能认识主要来自于对Nedd4家族的研究，它们在TGF-β、EGF、IGF、VEGF、SDF-1以及TNF-α等生长因子或细胞因子介导的信号通路中具有重要的调控作用。NEDL1和NEDL2是Nedd4家族中分子量最大的两个蛋白，NEDL1与人类神经退行性疾病、肿瘤和线虫对病原体的逃避反应等相关。与NEDL1相比，关于NEDL2的报道很少，仅发现NEDL2能够增强p73的转录激活能力以及LaminA突变或者敲低可增强NEDL2对细胞核中ATR激酶的降解。 为了更深入地研究NEDL2的功能，我们通过免疫沉淀/质谱鉴定（IP/MS）技术寻找NEDL2相互作用蛋白，发现很多候选分子与细胞周期调控相关，包括已经被报道的周期相关蛋白PRC1、NUSAP1、PLK1、CENPF、CEP170、CLASP2，APC/C泛素连接酶复合体的多个亚基，如ANAPC1（APC1）、ANAPC2（APC2）、CDC27（APC3）、ANAPC4（APC4）、ANAPC5（APC5）、CDC16（APC6）、ANAPC7（APC7）、CDC23（APC8）,以及它的激活因子Cdh1。验证发现Cdh1和NEDL2存在相互作用；我们对Cdh1与NEDL2的相互作用及意义进行了深入的研究，发现NEDL2在M期蛋白水平明显上升并且与纺锤体共定位，在退出M期时Cdh1能够通过APC/C促进NEDL2泛素化降解；NEDL2适量的水平保证了细胞周期正常进行，通过RNA干扰技术敲低NEDL2的表达，将导致细胞在分裂中期的停留时间明显延长，而过表达NEDL2则会导致染色体的不稳定，使染色体的分离出现错误；染色体分离出现错误是肿瘤产生的重要原因，为了验证NEDL2与肿瘤的关系，我们首先利用免疫组化的方法首次鉴定了NEDL2人组织表达谱，结果NEDL2在大脑、肾、肾上腺、肝、睾丸中有较高表达，在大肠、子宫、肺、胰腺几个组织中表达相对较低。我们利用组织芯片检测了这几种表达较低组织的相对应肿瘤中NEDL2表达情况，如结肠癌、直肠癌、宫颈癌、胰腺癌、肺癌，结果发现NEDL2在结肠癌和宫颈癌中高表达。 综上所述，我们在NEDL2的研究中获得了众多新的认识。首次揭示了NEDL2在细胞周期中后期转换调控中的功能，这不仅对于NEDL2的功能研究是一个突破性的进展，同时也发现了细胞中后期转换调控的新分子。研究也揭示了Cdh1是第一个调节NEDL2稳定性的重要蛋白。另外，NEDL2与肿瘤的相关性也是一个全新的认识，NEDL2与肿瘤发生发展关系的深入研究对于抗肿瘤药物靶点的寻找具有重要的意义。
【关键词】：蛋白质泛素化 泛素连接酶 NEDL2 细胞周期调控 APC/C-Cdh1
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：Q26
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 第1章 绪论11-22
• 1.1 泛素-蛋白酶体降解途径11-13
• 1.1.1 蛋白质降解途径11
• 1.1.2 泛素蛋白酶体通路11-13
• 1.2 HECT 类泛素连接酶13-18
• 1.2.1 HECT 类泛素连接酶结构与分类14-15
• 1.2.2 NEDD4 家族泛素连接酶结构和功能15-17
• 1.2.3 NEDL1 和 NEDL2 研究现状17-18
• 1.3 RING 类泛素连接酶18-21
• 1.3.1 SCF 复合体与 APC/C 复合体结构18-20
• 1.3.2 APC/C 复合体、周期调控与肿瘤20-21
• 1.4 本论文研究目的21-22
• 第2章 材料与方法22-28
• 2.1 材料22
• 2.2 方法22-28
• 第3章 泛素连接酶 NEDL2 相互作用蛋白筛选28-31
• 3.1 NEDL2 酶活中心失活载体构建28
• 3.2 IP/MS 筛选及结果分析28-30
• 3.3 本章小结30-31
• 第4章 APC/C-Cdh1 在 G1 期中下调 NEDL2 蛋白稳定性31-38
• 4.1 Cdh1 与 NEDL2 相互作用验证31
• 4.2 Cdh1 过表达下调 NEDL2 的蛋白水平31-32
• 4.3 Cdh1 下调 NEDL2 蛋白水平依赖于 APC/C32-33
• 4.4 NEDL2 在 G1，S，G2，M 期蛋白水平检测33-35
• 4.5 NEDL2 在 M 期到 G1 期过程蛋白水平检测35
• 4.6 MG132 处理上调内源 NEDL2 蛋白水平35-36
• 4.7 敲低 Cdh1 上调内源 NEDL2 蛋白水平36
• 4.8 本章小结36-38
• 第5章 NEDL2 参与细胞周期过程中-后期转换38-43
• 5.1 NEDL2 细胞定位分析38-39
• 5.2 敲低 NEDL2 引起细胞周期中期时间明显延长39-40
• 5.3 过表达 NEDL2 引起染色体不稳定40-41
• 5.4 本章小结41-43
• 第6章 NEDL2 蛋白正常组织及肿瘤组织表达情况检测43-45
• 6.1 NEDL2 蛋白水平组织表达谱43-44
• 6.2 不同肿瘤样本中 NEDL2 表达水平检测44
• 6.3 本章小结44-45
• 结论45-47
• 参考文献47-51
• 附录 A IP/MS 实验结果51-66
• 附录 B 主要仪器设备和常用试剂的配制66-69
• 1. 主要仪器设备66-67
• 2. 常用溶液的配制67-69
• 附录 C 表达载体构建引物69-70
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文70
• 已投稿尚未发表的论文70-71
• 致谢71

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