CRP转录后水平调节霍乱弧菌CAI-1合成酶基因cqsA的分子机制的初步研究及河弧菌的病原学及分子流行病学研究

发布时间：2017-10-17 13:00

  本文关键词：CRP转录后水平调节霍乱弧菌CAI-1合成酶基因cqsA的分子机制的初步研究及河弧菌的病原学及分子流行病学研究

  更多相关文章： 霍乱弧菌 CRP cqsA CAI-1 翻译融合 转座子 河弧菌 细胞毒性 药敏 毒力因子 PFGE 生物膜

【摘要】：群体感应(Quorum Sensing, QS)是细菌通过感应细胞密度变化来进行细胞间信息交流的重要机制。1970年首次在费氏弧菌(Vibrio fischeri, V. fischeri)中发现,之后证实在很多细菌中都存在群体感应现象,霍乱弧菌(Vibrio cholerae, V. cholerae)就是其中之一。霍乱是一种由霍乱弧菌引起的烈性传染病,致剧烈腹泻并能快速传播。世界第七次大流行自1961年延续至今,波及世界五大洲100多个国家,尚未得到有效控制。这与霍乱弧菌群体感应系统的调控作用息息相关。霍乱弧菌有三种不同的QS系统,包括CAI-1/CqsS, AI-2/LuxPQ和VarS/A-CsrA/BCD系统,在霍乱弧菌的致病性和环境生存等多个发面发挥重要的调节作用。本研究主要涉及到CAI-1/CqsS系统,以CAI-1(cholerae autoinducer1)为信号分子,cqsA为CAI-1合成酶编码基因,CqsS为CAI-1的膜结合组氨酸激酶受体(sensor kinase),由cqsS基因编码。cAMP受体蛋白CRP (cAMP receptor protein, CRP)是一全局性的转录调节子,cAMP是细胞内重要的第二信号分子,cAMP-CRP复合体可以通过结合于启动子附近的一段特异的保守序列(TGTGA-N6-TCACA),与RNA聚合酶相互作用来调节多种转录单元,涉及霍乱弧菌的生长代谢,毒力基因表达调控和QS系统等多个方面。 前期研究表明cAMP-CRP复合体在转录后水平调节CAI-1合成酶基因cqsA的表达,而缺失cAMP或CRP都会使cqsA mRNA的稳定性下降,本研究通过构建筛选指标简单的报告重组菌株系统,转座子随机插入寻找参与该调节过程中的调控元件和调控分子。通过自杀质粒介导的同源重组技术构建了染色体上单拷贝整合的cqsA-lacZ翻译融合报告重组菌株系统,cqsA-lacZ融合基因nRNA水平和CAI-1信号分子检测表明所构建的重组菌株系统满足工作需求,报告基因lacZ的表达和菌落蓝白斑表型变化忠实地反映CRP了对cqsA的调节。利用蓝白斑表型指标变化,筛选转座子随机插入突变文库,随机引物PCR确定转座子的插入位点,获得了若干插入位点基因,有待进一步证实。同时本实验还通过5'RACE的方法确定了cqsA基因的转录起始位点,位于起始密码子ATG上游41bp处。 河弧菌是一种食源性传播的病原菌,在世界范围内已有多次暴发和散发,尤其在发展中国家或是卫生条件较差的沿海地区是很严峻的公共卫生挑战。本课题对我国分离得到的43株河弧菌主要的毒力因子,病原学及分子流行病学特征进行了描述分析。 通过PCR检测了43株河弧菌株毒力基因、新陈代谢相关基因以及耐药相关基因的携带状况,并在分子水平上证实了一株精氨酸双水解酶基因缺失河弧菌株的存在。虽然所有菌株均检测到了毒力基因vfh, hupO和vfpA的存在,但每株菌产生溶血素、细胞毒素、蛋白酶的水平以及形成生物膜的能力则各有不同。药敏试验发现它们对β-内酰胺类、阿奇霉素及磺胺类药物有较强的耐药性,27%的菌株能够同时对两种或两种以上的抗生素耐药；而PFGE分析发现这些菌株间无明显亲缘关系,呈现高度多样性。 本研究首次对我国分离得到的河弧菌菌株的病原学及分子流行病学特征进行了比较系统的描述分析,发现了一些较为少见的生化特点。无论来源于病人还是环境的菌株均携带有毒力基因,但毒力因子的表达情况则各不相同。鉴于河弧菌可引起腹泻暴发流行,具有有公共卫生的风险,在以后的工作中我们应系统的收集引起暴发或散发病例的河弧菌株及其相关的流行学信息,进一步拓展对其致病性和感染的流行病学特征的了解和认识。
【关键词】：霍乱弧菌 CRP cqsA CAI-1 翻译融合 转座子 河弧菌 细胞毒性 药敏 毒力因子 PFGE 生物膜
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.3
【目录】：

• 目录4-6
• 缩略词6-7
• 第一部分7-36
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 前言12-16
• 材料与方法16-26
• 一. 材料16-17
• 二. 基本操作方法17-19
• 三. RNA相关操作19-21
• 四. 构建cqsA与VC2338(V.cholerae lacZ编码基因)翻译融合的重组菌株CLP4和WLP421
• 五. 构建cqsA与大肠杆菌lacZ基因翻译融合的重组菌株W△LP5和C△LP521-23
• 六. 构建crp基因回补菌株W△LP5-crp和WLP4-crp23
• 七. 构建的各菌株验证23-24
• 八. 利用转座子技术构建插入不同位点的突变体文库24-26
• 结果26-31
• 一、5'RACE确定cqsA基因的转录起始位点26
• 二、cqsA与VC2338基因翻译融合的重组菌株CLP4和WLP4的构建26-27
• 三、cqsA与大肠杆菌lacZ基因翻译融合的重组菌株W△LP5和C△LP5的构建27
• 四、crp基因回补菌株W△LP5-crp和WLP4-crp的构建27-28
• 五、构建菌株的验证28-29
• 六、利用转座子技术构建插入不同位点的突变体文库29-31
• 讨论31-33
• 小结33-34
• 参考文献34-36
• 第二部分36-63
• 中文摘要37-38
• Abstract38-39
• 前言39-41
• 材料与方法41-51
• 一. 材料41-43
• 二. 实验方法43-51
• 结果和讨论51-59
• 一、河弧菌的生化特性分析51-53
• 二、河弧菌毒力表型及其编码基因检测53-54
• 三、河弧菌的细胞毒性分析54-55
• 四、河弧菌生物膜形成能力分析55
• 五、河弧菌的药物敏感性分析55-57
• 六、河弧菌的PFGE结果分析57-59
• 小结59-60
• 参考文献60-63
• 附录 1.44 株河弧菌的生化表型及基因检测结果汇总63-65
• 综述65-78
• 参考文献73-78
• 致谢78

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 吴斌,马杰,林维宣;水产品中致病性弧菌的分离与鉴定[J];大连轻工业学院学报;2003年01期

2 韩善桥,马骢,陆晓白,郝秀红;我国沿海地区海水中致病性弧菌的调查[J];海军总医院学报;2003年04期

3 纪荣兴,胡石柳,邹文政,张坤宁;美国红鱼“腐皮病”病原的初步研究[J];海洋科学;2003年08期

4 张晓逸;一起河弧菌和豚鼠气单胞菌引起的食物中毒调查[J];江苏预防医学;2003年02期

，

本文编号：1048952