miR-302-367簇重组慢病毒载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达研究

发布时间：2017-10-17 18:11

  本文关键词：miR-302-367簇重组慢病毒载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达研究

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【摘要】：目的：本课题用携带miR-302-367簇的慢病毒感染人脐带间充质干细胞（human umilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs），尝试将hUCMSCs重编程为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stemcells，iPSCs），为后续研究奠定基础。 方法：1)采用组织块贴壁法分离、培养hUCMSCs，镜下观察细胞的生长情况，流式细胞仪分析细胞周期和细胞表面标志物;2)将miR-302-367簇的基因片段克隆到编码绿色荧光蛋白(Green fluorescentprotein，GFP)的慢病毒表达载体pLenO-DCE-Puro上，，经酶切和测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒pLenO-DCE-Puro-miR-302-367和包装质粒共同转染293T细胞，收集病毒上清，浓缩并测定病毒滴度；3)先用携带GFP的空慢病毒感染hUCMSCs，荧光镜下观察GFP的表达情况，流式细胞仪检测293T细胞中表达GFP+的细胞比例，从而确定最佳感染复数（Multiplicity of infection，MOI）；后将携带miR-302-367簇的慢病毒感染hUCMSCs，接种到饲养层上培养，观察细胞的形态变化。 结果：1)体外成功培养出hUCMSCs，细胞呈长梭形成纤维细胞样；细胞周期结果示细胞绝大多数处于G0/G1期(70.15%)，仅少数处于S期（5.85%）；细胞高表达CD29、CD105和CD90，低表达CD34、CD45；2)成功构建miR-302-367簇慢病毒表达载体pLenO-DCE-Puro-miR-302-367,经酶切及测序鉴定为正确克隆，并包装出慢病毒。其中，重组慢病毒的滴度为2×10~8TU/ml，空白对照慢病毒的滴度为1×10~9TU/ml；3)慢病毒感染hUCMSCs的最佳MOI值为20；感染组中检测到miR-302-367簇中各成员在细胞中高表达，而阴性对照组和未感染组未检测到相应表达；感染组中的细胞形态发生明显变化，由长梭形逐渐变为上皮细胞样或椭圆形，甚至出现克隆团，类似于胚胎干细胞样的形态，而其它两组的细胞无明显变化，仍为长梭形。 结论：1)从脐带中成功分离出hUCMSCs;2)成功构建重组慢病毒载体pLenO-DCE-Puro-miR-302-367,并包装出高滴度的慢病毒;3)重组慢病毒感染hUCMSCs后，细胞形态发生显著变化，但需进一步优化诱导iPSCs的条件。
【关键词】：人脐带间充质干细胞 miR-302-367簇 慢病毒 诱导性多能干细胞
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2;Q78
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照6-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-14
• 第一部分 原代细胞的培养14-21
• 第一节 人脐带间充质干细胞的分离、培养及其生物学特性14-18
• 1 材料与方法14-16
• 2 结果16-17
• 3 讨论17-18
• 第二节 MEF 饲养层细胞的制备18-21
• 1 材料与方法18-19
• 2 结果19-20
• 3 讨论20-21
• 第二部分 miR-302-367 簇重组慢病毒载体的构建、鉴定及包装21-28
• 1 材料与方法21-25
• 2 结果25-26
• 3 讨论26-28
• 第三部分 miR-302-367 簇重组慢病毒感染人脐带间充质干细胞及其对细胞的影响28-34
• 1 材料与方法28-32
• 2 结果32-33
• 3 讨论33-34
• 全文总结34-35
• 参考文献35-39
• 附图39-46
• 文献综述46-55
• 参考文献51-55
• 致谢55-56
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文56-57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 卢海;张志;赵毅超;饶小惠;江金群;孟镔;艾民;潘明新;高毅;;CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备[J];中国组织工程研究;2012年10期

2 葛秋燕;丁利军;颜桂军;刁振宇;孙海翔;胡娅莉;;人微小RNA-302s表达载体的构建及其对细胞周期的影响[J];中国细胞生物学学报;2010年03期

本文编号：1050289