利用VBIM系统筛选与EV71感染相关的宿主细胞因子

发布时间：2017-10-18 06:04

  本文关键词：利用VBIM系统筛选与EV71感染相关的宿主细胞因子

  更多相关文章： 插入突变 VBIM 肠道病毒71型 反向PCR 核孔蛋白Nup214

【摘要】：肠道病毒71型(Enterovirus71, EV71)是引起于足口病的重要病原体。近年来手足口病发病数和报告死亡病例数已居我国丙类传染病首位,成为迫切需要解决的公共卫生问题。目前EV71的致病机制尚未完全清楚,尚无特异性抗病毒治疗措施。寻找EV71感染细胞的相关宿主基因,对于明确EV71的致病机制,寻找有效的抗EV71药物靶标具有非常重要的意义。 基于慢病毒的可验证插入突变(Validation-Based Insertional Mutagenesis, VBIM)系统是一种前向遗传学方法,已在哺乳动物信号转导研究领域有比较成熟的应用,但多集中在肿瘤学研究领域。本课题将VBIM系统引入病毒学研究领域,并在哺乳动物细胞中开展了基于表型和功能的基因组学筛选,以期得到EV71生活周期所需的宿主因子和抑制EV71复制的宿主限制性因子。 我们首先以VBIM系统的三种载体质粒——VBIM-SD1/SD2/SD3分别包装慢病毒感染RD细胞,获得因VBIM-SD载体插入细胞基因组而产生的突变池；再以EV71病毒为筛选压力,获得了数个抵抗EV71感染的细胞克隆；利用编码Cre重组酶的逆转录病毒感染细胞,对细胞克隆中突变表型的可逆性进行检测,发现其中SD2-2细胞克隆的突变表型与VBIM-SD载体在宿主细胞基因组的插入突变有关；利用inverse PCR扩增SD2-2细胞中VBIM载体插入位点两侧的基因序列并进行测序,我们证明SD2-2细胞克隆中VBIM的插入位点位于核孔蛋白Nup214的第十四内含子中。进一步的研究表明,在SD2-2细胞克隆中,VBIM序列为反向插入并导致该突变细胞株中内源性核孔蛋白Nup214的表达明显降低,而当SD2-2细胞克隆中VBIM插入序列被Cre重组酶切除后,Nup214的表达及该细胞克隆对EV71的敏感性都得以回复,提示Nup214可能是EV71在RD细胞中复制所需的宿主因子。通过在HEK293T细胞中过表达Nup214,我们发现Nup214可以促进EV71的复制,进一步证明Nup214在EV71复制过程中的作用,表明我们通过VBIM系统筛选与病毒感染相关的宿主因子是可靠的。 本课题首次将VBIM系统引入病毒学研究,以EV71感染RD细胞为模型,利用这一可控、可逆的高效慢病毒启动子插入法在全基因组范围随机进行插入突变,发现了一个与EV71感染相关的宿主因子—Nup214。这一新的病毒感染相关基因筛选平台的建立,为进一步研究病毒与宿主相互作用提供了新思路和新手段。
【关键词】：插入突变 VBIM 肠道病毒71型 反向PCR 核孔蛋白Nup214
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-8
• 前言8-10
• 材料与方法10-31
• 1 材料10-18
• 1.1 细胞和病毒10
• 1.2 质粒10-12
• 1.3 生化试剂12-13
• 1.4 主要试剂盒13-14
• 1.5 抗体14
• 1.6 工具酶14
• 1.7 溶液14-16
• 1.8 引物序列16-17
• 1.9 主要仪器17-18
• 1.10 数据处理和分析软件18
• 2 方法18-29
• 2.1 细胞培养18
• 2.2 假病毒的包装与感染18-19
• 2.3 贴壁细胞全蛋白的抽提19
• 2.4 蛋白定量分析19-20
• 2.5 Western Blot检测蛋白质的表达20-22
• 2.6 免疫荧光22
• 2.7 基因组的提取22-23
• 2.8 质粒转化23
• 2.9 质粒的中量提取和纯化23-24
• 2.10 配制琼脂糖凝胶24
• 2.11 反转录PCR24-25
• 2.12 inverse PCR25-27
• 2.13 DNA电泳凝胶回收27-28
• 2.14 过表达带血凝素标签的Nup214蛋白的载体构建28-29
• 2.15 质粒转染29
• 3 技术方案29-31
• 研究结果31-43
• 1 以EV71感染致死为选择压力,利用VBIM系统筛选获得抵抗EV71感染的突变细胞克隆31-33
• 1.1 VBIM系统慢病毒的包装31
• 1.2 VBIM慢病毒转导RD细胞31-32
• 1.3 以EV71病毒为筛选压力,筛选获得抗EV71感染的突变细跑株32-33
• 2 利用CRE重组酶切除筛选细胞克隆中VBIM,验证因VBIM插入所致突变克隆的可逆性33-37
• 2.1 构建pMSCV-Cre-Puro病毒表达载体33
• 2.2 包装MSCV-Cre-puro逆转录病毒,在感染细胞中表达Cre重组酶33-34
• 2.3 通过观测表型回复确定突变细胞株表型是因VBIM的插入所致34-37
• 3 与EV71感染相关的宿主基因的发现37-38
• 4 对SD2-2突变细胞株基因组扩增产物——NUP214的分析38-41
• 4.1 SD2-2中VBIM插入方向的鉴定40
• 4.2 SD2-2中Nup214表达水平的检测40-41
• 5 在HEK293T中过表达NUP214可以促进EV71的复制41-43
• 5.1 构建带HA标签的表达载体41-42
• 5.2 过表达Nup214可以增强EV71病毒在HEK293T细孢中的复制42-43
• 讨论43-46
• 结论46-50
• 综述50-65
• 综述参考文献60-65
• 英文缩略语对照表65-68
• 个人简历68
• 发表文章68-69
• 致谢69-70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 扬帆 ,金奇 ,何雅青 ,李良成 ,候云德;The complete genome of Enterovirus 71 China strain[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2001年02期

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本文编号：1053336