细粒棘球绦虫果糖二磷酸醛缩酶的生物信息学分析及其表达、纯化和酶活性的检测

发布时间：2017-10-19 09:09

  本文关键词：细粒棘球绦虫果糖二磷酸醛缩酶的生物信息学分析及其表达、纯化和酶活性的检测

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【摘要】：目的：利用生物信息学方法分析细粒棘球绦虫果糖二磷酸醛缩酶(FBPA)的结构和功能特征,并利用基因工程技术进行克隆、表达、纯化,获得活性蛋白。 方法：利用多种生物信息学软件分析细粒棘球绦虫的FBPA的拓扑结构、生物学以及免疫功能特征等。限制性内切酶EcoR Ⅰ和HindⅢ对重组质粒FBPA/P-blue酶切FBPA目的片段,亚克隆入表达载体pET30a,筛选重组克隆并测序,将正确的重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细菌,异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白。Ni-NTA柱纯化重组蛋白,并建立酶反应体系,通过NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的变化来测定重组蛋白EgFBPA的酶催化活性。 结果：EgFBPA是一个全长的1092bp的基因,编码363个氨基酸,软件分析表明其等电点(PI)为8.34,分子量为39803.5Da。亚细胞定位分析显示该蛋白是无信号肽的细胞质蛋白,属于稳定蛋白。结构域和保守功能域的预测结果发现FBPAI的激活位点VYLEGTLLKPN (222aa-232aa)和TIMβ/α筒状结构(6aa-346aa)。二级结构以α-螺旋和环状结构居多,无跨膜区,有10种类型的活性位点。以1ADO A为模板,构建出了FBPA的三级结构。经PCR (聚合酶链反应)、双酶切和测序证实pET30a (+)-EgFBPA成功构建。SDS-PAGE (十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电)证实成功表达重组蛋白,且该蛋白是具有高效表达的可溶性蛋白。Ni-NTA柱子纯化后得到纯度较高的FBPA, Bradford法测定蛋白浓度为0.50±0.02mg/ml。 结论：经生物信息学预测细粒棘球绦虫FBPA与人的FBPA的同源性是69%。EgFBPA可能是潜在的药物靶点。重组质粒Pet30a (+)-FBPA在大肠杆菌BL21中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度的有活性的蛋白,为进一步研究其生物学功能及其抗体、药物靶点的研制奠定了基础。
【关键词】：细粒棘球绦虫 果糖二磷酸醛缩酶(FBPA) 分子克隆 蛋白纯化 生物信息学预测
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R383.33;Q78
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 目录7-9
• 前言9-12
• 第一章 利用EST序列进行生物信息学预测12-27
• 1.1 材料12
• 1.2 方法12-13
• 1.3 结果13-25
• 1.4 讨论25-26
• 1.5 小结26-27
• 第二章 细粒棘球绦虫成虫EgFBPA重组蛋白的诱导表达、纯化27-41
• 2.1 材料27-28
• 2.2 方法28-35
• 2.3 结果35-39
• 2.4 讨论39-40
• 2.5 小结40-41
• 第三章 细粒棘球绦虫成虫EgFBPA重组蛋白的酶活性的检测41-46
• 3.1 材料41
• 3.2 方法41-43
• 3.3 结果43-44
• 3.4 讨论44-45
• 3.5 小结45-46
• 第四章 结论46-47
• 4.1 主要结论46
• 4.2 研究的局限性及展望46-47
• 参考文献47-52
• 综述52-55
• 参考文献54-55
• 在读期间研究成果55-56
• 致谢56-57
• 英文缩略语表57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1060230