SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的建立及诱导分化为心肌（样）细胞的体外实验研究

发布时间：2017-10-20 00:39

  本文关键词：SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的建立及诱导分化为心肌（样）细胞的体外实验研究

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【摘要】：目的：间充质干细胞(MSCs Mesenchymal stem cells)是心肌修复的理想种子细胞。本文建立了SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs Bone marrow-mesenchymal stem cells)体外分离培养技术,同时探讨了BMSCs体外诱导为心肌(样)细胞的有效方法及如何提高分化效率,通过技术的建立和初步的机制研究为今后BMSCs来源的心肌(样)细胞在心肌修复方面的研究和应用提供实验依据。 方法： 1、无菌条件下分离4周龄SD大鼠的长骨,用体积分数为10%FBS,DF-12完全培养基冲洗骨髓腔,采用经典的全骨髓细胞贴壁法联合频繁换液法和差速消化法,培养SD大鼠BMSCs,自然传代法体外扩增BMSCs。倒置显微镜和瑞氏--姬姆萨染色观察BMSCs的形态结构；绘制生长曲线了解BMSCs的生长特点和细胞倍增时间；克隆形成实验检测BMSCs的自我更新能力；使用小鼠抗大鼠的单克隆抗体CD2、CD45、CD90.1,通过流式细胞技术鉴定BMSCs的分子表面标志FITC-anti-Mouse/Rat CD29、PE-anti-Rat CD45、PE-anti-mouse/rat CD90.1(Thy-1)。 2、用浓度为5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L的5氮杂胞苷(5-Azacytidine、5-AZA)分别诱导体外扩增到第四代的大鼠BMSCs,以下简称为P4代BMSCs(P4代BMSCs:CD29、CD45、CD90表达率分别为99.9%、0.8%、99.6%),并设计两组诱导时间即24小时和48小时。通过倒置显微镜观察经诱导细胞的形态结构；利用免疫荧光染色鉴定经诱导的细胞中心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI, Cardiac troponinⅠ)的表达情况。分析不同浓度的5-AZA在BMSCs体外心肌化效率中的差异,探讨体外心肌化的最佳的诱导条件。 3、用浓度为10μmol/L5-AZA分别诱导体外扩增到第一代的SD大鼠骨髓间充质干细胞,以下简称为P1代BMSCs (P1代BMSCs的CD29、CD45、CD90表达率分别为100%、14.7%、16.5%,))和P4代BMSCs(P4代BMSCs:CD29、CD45CD90表达率分别为99.9%、0.8%、99.6%)24小时,对照组用体积分数为10%FBS,DF-12完全培养基培养P1代和P4代BMSCs,两组细胞分别培养2周和4周。倒置显微镜和瑞氏--姬姆萨染色观察经诱导细胞的形态结构；免疫荧光染色鉴定经诱导细胞中cTnI的表达情况。分析不同代数的BMSCs体外心肌化效率中的差异,从而探讨体外心肌化的最佳的诱导条件。 结果： 1、原代刚分离培养的BMSCs悬浮状生长、圆形、体积小、数量多、折光性强。培养4小时后,进行首次换液,去除大量的悬浮的造血干细胞,部分细胞完成贴壁,细胞体积小、呈圆形、细胞形状未改变。培养24小时,细胞完成贴壁,贴壁细胞形态不一,呈多角形、短梭形、纺锤体外观,少数视野可见1-2个细胞集落。细胞集落由数十个细胞组成,其上附着的大量造血干细胞。随着培养天数的增加,细胞集落逐步增多、变大,悬浮的造血干细胞不断减少。原代培养第5天,彼此靠近的集落完全融合,连接成片,呈放射状或平行状排列,铺满瓶底的80%左右,可进行首次传代培养。P1代至P4代BMSCs均呈典型纺锤体外观,旋涡状排列生长,培养3天左右铺满瓶底的80%,可再次传代,具有良好的增殖能力。细胞克隆形成实验提示：P1代和P4代BMSCs的克隆形成率分别是10.8%和8.9%。P1代和P4代BMSCs生长曲线呈S形,符合Logistic的生长曲线；其倍增时间分别为27.7小时和43.2小时。流式细胞技术动态监测P1代和P4代BMSCs的分子表面标志：P1代BMSCs CD29、CD45、CD90表达率分别为100%、14.7%、16.5%；P4代BMSCs的分子表面标志CD29、CD45、CD90表达率分别为99.9%、0.8%、99.6%。 2、用5μmol/L5-AZA诱导P4代BMSCs24小时或48小时,BMSCs的增殖未受到明显抑制,细胞的大小、形态并未发生明显改变,并且免疫荧光染色鉴定培养4周的细胞不表达cTnI;用10μmol/L的5-AZA诱导P4代BMSCs24小时,约20%的细胞从培养瓶脱落,其余的BMSCs的增殖明显受到抑制,细胞形态由原来的纺锤体形逐渐变成椭圆形,出现心肌纤维的特征,且免疫荧光染色鉴定培养4周的细胞表达cTnI;用10μmol/L的5-AZA诱导P4代BMSCs48小时,或用15μmol/L的5-AZA诱导P4代BMSCs24小时或48小时,BMSCs的增殖明显受到抑制,约75%的细胞从培养瓶上脱落死亡,其余细胞由于生长密度过低停止生长。 3、用浓度为10μmol/L的5-AZA分别诱导P1代和P4代BMSCs24小时,P1代和P4代BMSCs形态均由原来的纺锤体形逐渐变成椭圆形,具有心肌纤维的特征。经诱导细胞的cTnI为阳性。P1代和P4代BMSCs经诱导的细胞中cTnI的阳性率分别为(23±2)%和(36±3)%,然而仅有P4代BMSCs经诱导后可观察到“肌岛”和多核肌管,经诱导的细胞cTnI的荧光强度较强。 结论： 1、采用全骨髓细胞贴壁法联合频繁换液法和差速消化法可在短期内获得生长状态良好、增殖能力强、纯度较高的BMSCs。 2、5-AZA诱导BMSCs为心肌(样)细胞的最佳的工作浓度为10μmol/L,最佳的作用时间为24小时。 3、P4代BMSCs有较强的心肌化潜力。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 分化 心肌(样)细胞 5-氮杂胞苷
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中英文缩略词5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 引言12-14
• 第一部分 S D大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的建立14-29
• 一 实验材料14-15
• 二 实验方法15-19
• 三 实验结果19-26
• 四 讨论26-27
• 五 本部分实验结论27-29
• 第二部分 S D大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌(样)细胞的体外实验研究29-43
• 一 实验材料29-31
• 二 实验方法31-33
• 三 实验结果33-40
• 四 讨论40-42
• 五 本部分实验结论42-43
• 总结43-45
• 论文参考文献45-48
• 文献综述48-60
• 综述参考文献56-60
• 攻读学位期间发表文章情况60-61
• 致谢61

【参考文献】

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本文编号：1064297