FoxM1核酸探针的构建及应用

发布时间：2017-10-20 10:27

  本文关键词：FoxM1核酸探针的构建及应用

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【摘要】：核酸探针，是指能够与特定的靶分子发生特异性的相互作用，并被特定方法探知的分子，是一种可以从分子水平上进行设计、合成以及应用的新兴研究手段，为推动分子生物学和分子医学的发展起了重要的作用。 本论文以ForkheadBox（Fox）转录因子家族中的FoxM1为靶标，建立了一套筛选能够特异性、高亲和力靶定转录因子FoxM1的核酸适配体（aptamer）的SELEX（指数富集配体进化技术）体系，并对筛选得到的核酸适配体与靶物质的特异性与亲和力进行了验证。在此基础上，构建了一种利用分子信标（MB）简单、快速、超微量检测脱氧核酶酶切产物的方法。 主要工作如下： 1．建立了一套筛选特定蛋白的SELEX技术方法。运用已构建正确的PGEX-4T-1-GST-FoxM1-220-335以及PGEX-4T1-GST质粒，在大肠杆菌中表达并纯化了GST-FoxM1-220-335融合蛋白及其GST蛋白，经过八轮体外筛选得到了四条核酸适配体。 2．对筛选得到的核酸适配体对靶物质的其特异性与亲和力进行了验证。经荧光检测、核酸凝胶阻滞实验（EMSA）和免疫共沉淀实验（co-ip）等证实筛选得到的核酸适配体能够特异性、高亲和力的靶定转录因子FoxM1。 3．基于微球富集技术，利用筛选得到的核酸适配体在体外检测GST-FoxM1-220-335。 4．在附录B中，我们建立了一种利用分子信标简单、快速、超微量检测脱氧核酶酶切产物的方法。分子信标（MB）被用来检测模拟的HCV-RNA酶切产物，检测下限为0.02nmol/L。
【关键词】：核酸探针 FoxM1 蛋白 制备 应用 检测
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 英文缩写7-8
• 目录8-10
• 第1章 绪论10-16
• 1.1 前言10
• 1.2 SELEX 技术简介10-11
• 1.3 核酸适配体（aptamer）简介11-12
• 1.4 转录因子 FoxM1 简介12-13
• 1.5 分子信标简介13-14
• 1.6 本文构思14-16
• 1.6.1 研究目的14
• 1.6.2 研究方法及技术14-16
• 第2章 GST-FoxM1-220-335 融合蛋白的纯化16-22
• 2.1 前言16-17
• 2.2 实验材料17-18
• 2.3 实验方法18-19
• 2.3.1 重组质粒的转化与小量提取18-19
• 2.3.2 重组质粒的酶切与鉴定19
• 2.3.3 GST-FoxM1-220-335 融合蛋白的纯化19
• 2.4 实验结果19-21
• 2.4.1 质粒的转化和鉴定19-20
• 2.4.2 GST-FoxM1-220-335 融合蛋白的纯化20-21
• 2.5 讨论21-22
• 第3章 转录因子 FoxM1 核酸探针的构建22-38
• 3.1 前言22-23
• 3.2 实验材料23-24
• 3.3 实验方法24-31
• 3.3.1 SELEX 文库的构建及其引物的设计24-25
• 3.3.2 转录因子 FoxM1 核酸适配体的筛选25-27
• 3.3.3 克隆测序及二级结构分析27
• 3.3.4 核酸适配体与 FoxM1 结合能力分析27-31
• 3.4 实验结果31-36
• 3.4.1 转录因子 FoxM1 核酸适配体的筛选31-33
• 3.4.2 核酸适配体与 FoxM1 结合能力分析33-36
• 3.5 讨论36-38
• 第4章 基于微球富集的核酸适配子体外检测转录因子转录因子 FoxM138-43
• 4.1 前言38-39
• 4.2 实验材料39
• 4.3 实验方法39-41
• 4.3.1 核酸探针的设计39-40
• 4.3.2 实验条件优化40
• 4.3.3 基于微球富集技术利用核酸适配子体外检测转录因子转录因子 FoxM140-41
• 4.4 实验结果41-42
• 4.4.1 实验条件优化41-42
• 4.4.2 基于微球富集核酸适配子体外检测靶蛋白 GST-FoxM1-220-33542
• 4.5 讨论42-43
• 结论43-45
• 参考文献45-49
• 附录A 攻读硕士学位期间发表的论文目录49-50
• 附录B 分子信标用于脱氧核酶切割产物的快速检测50-55
• B.1 前言50
• B.2 实验材料50-51
• B.3 实验方法51-52
• B.3.1 人工合成的脱氧核酶酶切产物的检测51-52
• B.3.2 脱氧核酶模拟的 HCV-RNA 酶切产物的检测52
• B.4 实验结果52-54
• B.4.1 人工合成的脱氧核酶酶切产物的检测52-53
• B.4.2 脱氧核酶模拟的 HCV-RNA 酶切产物的检测53-54
• B.5 讨论54-55
• 附录C 常用缓冲液和试剂配方55-58
• 致谢58

【共引文献】

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本文编号：1066789