鼠伤寒沙门菌spvB、spvC基因缺陷变异株的构建及其生物学特性研究

发布时间：2017-10-21 13:08

  本文关键词：鼠伤寒沙门菌spvB、spvC基因缺陷变异株的构建及其生物学特性研究

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【摘要】：目的： 构建鼠伤寒沙门菌spvB、spvC基因缺陷变异株，并对其生物学特性进行比较研究。为探讨鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因spvB、spvC致病机制提供理论和实验依据，并为后续细胞实验及利用小鼠模型进一步研究该基因的功能提供工具和手段。 方法： 1、用自杀质粒介导的同源重组方法，制备鼠伤寒沙门菌spvB/spvC基因缺陷变异株。根据GeneBank数据库中鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因spvB/spvC序列，用Primer Premier5.0软件设计PCR特异性引物，并在各个引物5’末端加上适当的酶切位点，，分别扩增获得spvB/spvC基因缺陷性核苷酸片段后，连接至自杀质粒pCVD442。将重组的阳性自杀质粒转化入感受态细菌SM10λpir内，并以接合转移的方法导入含有spvB/spvC基因的鼠伤寒沙门菌野生株中，用蔗糖诱导同源重组。以PCR扩增方法观察重组现象，将完全重组的菌株作为spvB/spvC基因的缺陷变异株，挑选稳定传代的突变株并进行基因测序鉴定。 2、鼠伤寒沙门菌spvB、spvC基因缺陷变异株及野生株的生物学特性比较研究。对两个缺失菌株的遗传稳定性、生长特性及酸性条件下的生存能力进行比较研究。分别将菌株在LB液体培养基中37℃培养12h，每隔1h取样平板计数。将菌株分别在LB琼脂平板中连续传代50代，每隔5代挑取单菌落，PCR扩增鉴定，以研究缺失的基因在鼠伤寒沙门菌基因缺陷变异株中的遗传稳定性。用2mL PH4.0的新鲜LB培养基分别培养基因缺失菌株及野生型鼠伤寒沙门菌2h，从第0h起每隔1h取菌液适当稀释后采用平板活菌计数法测定活菌数，计算生存率。 结果： 1、成功构建鼠伤寒沙门菌spvB、spvC基因缺陷株，经PCR及序列分析证实，spvB变异株中spvB基因的编码区有1749个碱基缺失，spvC基因变异株中spvC基因的编码区有711个碱基缺失，且没有发生极性突变。 2、基因缺陷变异株与野生型相比，无酸条件下的生长特性没有明显差别。酸性条件下，spvB、spvC基因缺陷株和野生株的活菌数都比非酸性条件下的活菌数明显降低；且三组菌株在培养第2h时后的生存率均低于第1h后的生存率，差异有明显统计学意义（P0.01）。spvB、spvC基因缺陷株在酸性环境中培养1h、2h后接种到LB平板生长的菌落数（活菌数）比野生株明显减少（P0.01），且生存率均低于野生株（P0.05），差异有统计学意义。两种单基因缺陷株相比在第1h的活菌数及生存率的差异无统计学意义（P0.05）；在第2h的spvB基因缺陷株的活菌数低于spvC基因缺陷株的活菌数，差异有统计学意义（P0.05），但生存率的差异无统计学意义（P0.05）。 结论： 1、运用自杀质粒成功构建了鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因spvB/spvC基因缺陷变异株；为进一步研究该质粒基因的功能提供了工具和手段。 2、基因缺陷变异株与野生型相比，在无酸条件下的生长特性没有明显差别；酸性环境对沙门菌的生长有一定的选择性，且在接触酸性环境的2h内随着时间的延长选择性逐渐增强；沙门菌质粒毒力基因spvB、spvC在鼠伤寒沙门菌克服酸应激时可能发挥重要作用，但两基因之间比较对耐酸的影响无明显差异。
【关键词】：鼠伤寒沙门菌 spvB spvC 基因缺陷变异 同源重组 生长曲线
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-11
• 第1章 前言11-15
• 第2章 鼠伤寒沙门菌 spvB 基因缺陷变异株的构建15-36
• 2.1 材料15-18
• 2.1.1 菌株、质粒15-16
• 2.1.2 主要试剂及仪器16
• 2.1.3 主要培养基及试剂配制16-18
• 2.2 方法18-27
• 2.2.1 技术路线18-19
• 2.2.2 PCR 引物设计19
• 2.2.3 spvB 基因缺陷同源性核苷酸片段的克隆19-25
• 2.2.4 重组自杀质粒 pCVD-ΔspvB 的构建、转化及鉴定25-26
• 2.2.5 鼠伤寒沙门氏菌 spvB 基因缺陷变异株的构建及鉴定26-27
• 2.3 结果27-34
• 2.3.1 PCR 扩增 spvB 基因上、下游片段27-28
• 2.3.2 重组质粒 pMD-ΔspvB 的克隆及鉴定28-29
• 2.3.3 重组自杀质粒 pCVD-ΔspvB 的克隆及鉴定29-30
• 2.3.4 鼠伤寒沙门菌 spvB 基因缺陷变异株的制备及鉴定30-31
• 2.3.5 测序结果及分析31-34
• 2.4 讨论34-36
• 第3章 鼠伤寒沙门菌 spvC 基因缺陷变异株的构建36-46
• 3.1 材料36
• 3.2 方法36-38
• 3.2.1 技术路线36
• 3.2.2 PCR 引物设计36
• 3.2.3 spvC 基因缺陷同源性核苷酸片段的克隆36-37
• 3.2.4 重组自杀质粒 pCVD-ΔspvC 的构建、转化及鉴定37
• 3.2.5 鼠伤寒沙门氏菌 spvB 基因缺陷变异株的构建及鉴定37-38
• 3.3 结果38-44
• 3.3.1 PCR 扩增 spvC 基因上、下游片段38
• 3.3.2 重组质粒 pMD-ΔspvC 的克隆及鉴定38-39
• 3.3.3 重组自杀质粒 pCVD-ΔspvC 的克隆及鉴定39-40
• 3.3.4 鼠伤寒沙门菌 spvC 基因突变株的制备及鉴定40-41
• 3.3.5 测序结果及分析41-44
• 3.4 讨论44-46
• 第4章 鼠伤寒沙门菌 spvB、spvC 基因缺陷株生长特性的测定46-53
• 4.1 材料46-47
• 4.1.1 菌株46
• 4.1.2 主要试剂及仪器46
• 4.1.3 主要培养基及试剂配制46-47
• 4.2 方法47-48
• 4.2.1 鼠伤寒沙门菌 spvB、spvC 基因缺陷株遗传稳定性测定47
• 4.2.2 鼠伤寒沙门菌 spvB、spvC 基因缺陷株的生长特性鉴定47
• 4.2.3 酸性条件下的生存能力检测47-48
• 4.2.4 统计学分析48
• 4.3 结果48-51
• 4.3.1 spvB、spvC 基因缺陷变异株的遗传稳定性48-49
• 4.3.2 spvB、spvC 基因缺陷株及野生株的生长特性鉴定49-50
• 4.3.3 spvB、spvC 基因缺陷株及野生株酸性条件下的生存能力检测50-51
• 4.4 讨论51-53
• 第5章 结论和展望53-54
• 5.1 结论53
• 5.2 展望53-54
• 致谢54-55
• 参考文献55-60
• 攻读学位期间公开发表的论文60
• 本课题所获的基金资助60-61
• 综述61-69
• 参考文献67-69

【参考文献】

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1 陈庆法;陈强;余晓君;周红平;柯江维;朱春晖;段荣;;腹泻儿童沙门菌的耐药性研究及肠毒素基因与临床关系分析[J];中华临床医师杂志(电子版);2011年18期

本文编号：1073514