斑马鱼肾脏疾病和再生模型的构建及初步研究

发布时间：2017-10-24 13:36

  本文关键词：斑马鱼肾脏疾病和再生模型的构建及初步研究

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【摘要】：肾脏是人体的重要器官,发育自中间中胚层,发挥着从血液中滤过代谢废物并维持体内正常酸碱和渗透压平衡的重要作用。在脊椎动物中,肾脏的最小功能单位是肾单元,包括滤过性功能的肾小球,再吸收功能的肾小管以及运输和排泄功能的收集管。当肾单元发育缺陷或大多数肾单元结构损伤时,肾脏功能不能正常发挥,引发多种肾脏疾病。肾脏疾病具有病因复杂、并发症多、发病人群广泛等特点,临床上的检测方法包括测量血中氮含量或尿中蛋白含量。多数肾脏疾病发展到晚期形成终末期肾衰竭,血液透析或肾脏移植是临床上常用的治疗手段。肾脏如何进行损伤后再修复对于探索肾脏疾病的临床治疗十分重要。有报道显示在哺乳动物成年肾脏中存在肾脏损伤后再修复的证据,但是关于肾脏损伤后再修复的机制仍然知之甚少。因此,肾脏发育的分子调控、肾脏疾病的致病机制及肾脏损伤后再修复的分子生物学机制是近年来肾脏领域研究的热点。斑马鱼是新兴的模式动物,具有体外受精、胚胎透明和遗传操作方便等独特优势。本研究中,我们以斑马鱼为模式动物着手肾脏发育、疾病和再生展开研究。主要研究议题为：1,构建斑马鱼肾脏滤过性模型；2,斑马鱼肾.脏前肾管突变体的遗传筛选及初步研究；3,构建斑马鱼肾脏再生模型。斑马鱼肾脏滤过性模型的构建对于体外实时监测斑马鱼肾脏滤过性功能,评估肾脏健康状况具有十分重要的意义；基于斑马鱼肾脏前肾管突变体遗传筛选和机制研究,有助于深入了解斑马鱼肾脏发育的分子调控网络和肾脏疾病的致病机制,进而可能为人类肾脏发育和疾病的研究提供间接理论参考;构建斑马鱼肾脏再生模型为肾脏再生机制研究和肾脏再生的正向遗传筛选提供了实验材料。本研究第一部分中,我们通过建立一系列斑马鱼肾脏特异性表达基因的转基因品系。具体来说包括：肾小球特异性表达基因podocin转基因品系Tg(podocin:eGFP)和Tg(podocin: dsRed);肾脏早期发育决定基因pax2a转基因品系Tg(pax2a:eGFP)前肾管特异性表达基因cdh17和enpep的转基因品系Tg(cdh17:eGFP), Tg(cdhl7:dsRed)和Tg(enpep:dsRed)。最终,我们将这些转基因品系与实验室已有的血管转基因品系Tg(flkl:mcherry)杂交,初步实现了体外实时监测斑马鱼肾脏滤过性功能的模型。本研究第二部分中,我们对262个ENU诱变突变基因组的F2家族进行遗传筛选,具体为在突变基因组自交家族后代胚胎3.5dpf时,通过APStaining方法对斑马鱼肾脏前肾管染色,显微镜下观察斑马鱼前肾管表型。最终,我们在30个突变基因组自交家族中找到了57对斑马脏前肾管疑似突变体,结合疑似突变体前肾管表型对疑似突变体进行了简单的表型归类。具体为：1,突变体前肾管发育迟缓或缺陷；2,突变体前肾管迁移异常或缺陷；3,突变体前肾管膨胀。在这些突变体中,我们注意到一个非常有意思的前肾管膨胀表型突变体V3-5。经过突变体表型深入分析,同时结合已有的相关报道,我们推测V3-5突变体前肾管膨胀表型是肾脏囊肿疾病的前期表现。目前,我们正在着手寻找V3-5突变体的致变基因。本研究第三部分中,我们利用NTR/Mtz系统,成功构建了斑马鱼肾脏特异性表达基因podocin和cdh17的斑马鱼肾脏再生模型,为未来斑马鱼肾脏再生机制研究和肾脏再生正向遗传筛选提供了实验材料。通过本研究,最终我们：1,初步建成了斑马鱼肾脏滤过性功能监测模型；2,遗传筛选获得了多种斑马鱼前肾管突变体；3,成功构建了斑马鱼肾脏再生模型。
【关键词】：斑马鱼 ENU诱变筛选 肾脏滤过性 肾脏疾病 肾脏再生
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692;R-332
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 第一部分 文献综述11-21
• 前言11
• 1.1 肾脏发育11-15
• 1.1.1 中胚层的起源11-12
• 1.1.2 哺乳动物肾脏的形态发生12-13
• 1.1.3 斑马鱼肾脏的形态发生13-14
• 1.1.4 肾脏形态建成的基因调控14-15
• 1.2 肾脏疾病15-17
• 1.2.1 慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease,CKD)15-16
• 1.2.2 急性肾脏损伤(Acute kidney injury,AKI)16
• 1.2.3 遗传型肾脏疾病(Genetic kidney diseases)16-17
• 1.2.4 肾小球滤过率(GFR)17
• 1.2.5 蛋白尿(Proteinuria)17
• 1.3 肾脏再生17-18
• 1.3.1 斑马鱼再生模型17-18
• 1.4 ENU筛选18-19
• 1.5 tol2转座子系统19-21
• 第二部分 材料和方法21-31
• 2.1 实验动物21
• 2.2 试剂、耗材和仪器21
• 2.3 试剂配置21-25
• 2.3.1 LB培养基的制备22
• 2.3.2 原位杂交相关溶液22-23
• 2.3.3 其他溶液23-24
• 2.3.4 大肠杆菌E.coli化学感受态细胞的制备24
• 2.3.5 Taq DNA polymerase的制备与提纯24-25
• 2.4 质粒和菌株25
• 2.5 实验方法25-31
• 2.5.1 斑马鱼基因组DNA提取25-26
• 2.5.2 重组质粒的构建26-27
• 2.5.3 反义RNA探针的制备27-28
• 2.5.4 全胚RNA原位杂交(Whole Mount RNA in situ hybridization)28
• 2.5.5 斑马鱼前肾肾管染色(AP Staining)28-29
• 2.5.6 全胚免疫组化(Whole Mount Immunohistochemistry,IHC)29
• 2.5.7 胚胎显微注射29-30
• 2.5.8 转基因品系的鉴定30-31
• 第三部分 实验结果31-47
• 3.1 肾小球滤过性模型的构建31-36
• 3.1.1 肾小球足细胞特异表达基因podocin31-33
• 3.1.2 前肾早期发育决定基因pax2a33-34
• 3.1.3 前肾管特异性表达基因cdh1734-35
• 3.1.4 前肾管特异性表达基因enpep35-36
• 3.2 斑马鱼前肾管突变体的ENU遗传筛选36-43
• 3.2.1 斑马鱼前肾管发育缺陷突变体36-37
• 3.2.2 斑马鱼前肾管膨胀突变体37-39
• 3.2.3 V3-5前肾管膨胀突变体表型深入分析及致变基因初探39-43
• 3.3 斑马鱼肾脏再生模型的构建43-47
• 3.3.1 斑马鱼肾管特异性表达基因podocin再生模型43-44
• 3.3.2 斑马鱼肾管特异性表达基因cdh17再生模型44-47
• 第四部分 讨论和分析47-49
• 参考文献49-53
• 致谢53

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本文编号：1089001