低氧拮抗细胞程序性坏死的作用及其机制研究

发布时间：2017-10-25 01:13

  本文关键词：低氧拮抗细胞程序性坏死的作用及其机制研究

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【摘要】：传统的细胞程序性死亡概念特指细胞凋亡，而细胞坏死则被认为是细胞被动死亡方式。近年来的研究发现，与机体遭遇物理、化学损伤及严重感染时细胞发生被动的坏死不同，一些体外培养的细胞在肿瘤坏死因子α（TNFα）作用下会发生细胞死亡，但加入Caspase抑制剂阻断Caspase活性，并不能阻断反而促进细胞死亡，且死亡细胞呈现坏死的表型。由于这种坏死受到死亡受体介导的信号调控，具有明确的调控蛋白，符合程序性细胞死亡的特性，因而被命名为程序性坏死（Necroptosis)，鉴于该死亡过程依赖于RIP激酶的活性调控，因此程序性坏死也被定义为依赖于RIP1/RIP3的细胞坏死。 程序性坏死与临床疾病的相关性引发关注，在动物的缺血性脑梗和心梗模型中，已发现RIP1激酶抑制剂Necrostain-1(Nec-1)可有效减少梗死面积降低细胞的死亡，提示拮抗细胞程序性坏死可用于治疗缺血再灌流带来的实质脏器损伤。 适度低氧对健康的促进作用是近年来的研究热点，通常在低氧的环境下，细胞内低氧诱导因子(HIF-1α)稳定性增强，激活下游靶基因如VEGF、BNIP3等转录，通过激活这些基因的表达，细胞可以抵抗在常氧无法抵抗的外界应激和适应缺血缺氧的环境。大量研究显示在脑梗、心梗等缺血缺氧性疾病中，低氧预处理可以帮助细胞对抗细胞凋亡的发生，由于RIP1激酶抑制剂Nec-1同样可有效降低心梗、脑梗的死亡面积，证实调控程序性坏死也是有效阻断细胞缺血缺氧死亡的重要策略。因此，低氧保护是否也涉及拮抗细胞程序性坏死成为我们研究的主要科学问题。 我们首先在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞建立了由肿瘤坏死因子α(TNFα)介导的细胞程序性坏死模型，研究结果证实TNF-α能呈时间、剂量依赖性地诱导SH-SY5Y细胞死亡，同时广谱Caspase抑制剂zVAD能显著增强TNF-α的细胞毒性，而使用RIP1激酶抑制剂Nec-1或敲低RIP3可拮抗细胞死亡的发生。对TNF-α诱导死亡的细胞进行检测，未发现存在凋亡小体、PARP剪切等细胞凋亡的特征，上述结果表明TNF-α在SH-SY5Y细胞介导了程序性坏死的发生。 随后，利用TNFα诱导的SH-SY5Y细胞程序性坏死的模型，我们观察了低氧处理对细胞程序性坏死的影响。我们分别采用10%O2和3%O2对细胞进行处理，结果发现3%O2能更有效的保护细胞对抗TNF-α介导的程序性坏死，以此为模型进行了后续有关低氧拮抗程序性坏死的作用机制研究。 在前期有关低氧保护细胞免于凋亡的相关研究中发现，低氧介导的HIF-1α信号活化可以激活靶基因BNIP3，进而通过启动线粒体自噬在低氧中对细胞起保护作用。为探究HIF-1α信号活化是否同样涉及拮抗细胞程序性坏死的发生，我们采用RNA干涉技术敲低SH-SY5Y细胞中的HIF-1α基因，结果显示敲低HIF-1α可明显抑制低氧诱导的BNIP3的表达，但不管是敲低HIF-1α或者敲低BNIP3的表达，都并不影响低氧对SH-SY5Y细胞的保护作用。这些结果证实低氧拮抗TNFα诱导的细胞程序性坏死并不依赖于HIF-1信号。 TNFα介导的NF-κB信号通路活化在细胞凋亡及坏死过程中都起着重要的负反馈作用，我们发现虽然抑制NFκB信号通路活化可以显著增强TNFα介导的细胞坏死，但低氧对细胞坏死的拮抗作用并不依赖于激活NF-κB信号。我们在低氧处理后的细胞信号通路中检测中发现低氧可抑制TNF-α对JNK信号的活化，并能拮抗细胞坏死。而pan-caspase抑制剂zVAD-fmk与TNF-α联用可以通过增强JNK信号活化破坏低氧的保护作用，使用JNK激酶抑制剂SP600125可以完全恢复低氧的保护效果，提示低氧的保护作用依赖于对JNK激活的抑制。 我们在实验中还观察到采用雷帕霉素或者PI3K激酶抑制剂LY294002启动自噬可以在常氧状态下拮抗TNFα介导的SH-SY5Y细胞程序性坏死，，但两种试剂对低氧的保护却并无协同作用。我们发现常氧时TNF-α处理后6小时可以诱导细胞自噬，而低氧可促使自噬在TNF-α处理后3h发生，提示早期启动自噬有可能参与到低氧的保护机制中。 线粒体是细胞内ROS产生的重要器官，而过量产生的ROS与JNK活化及细胞死亡之间的关联已经得到大量实验证实。我们对低氧保护下线粒体复合体Ⅰ的活性、线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential，MMP）、ROS的产生和ATP生成进行了检测。结果发现低氧并不能恢复TNF-α诱导的线粒体去极化，但线粒体复合体Ⅰ活性受到抑制、ROS的产生减少、ATP的合成减少。即低氧时细胞代谢受到抑制是细胞启动了自我保护的一种方式，通过主动降低细胞代谢，抑制了ROS的产生，阻断了JNK激酶的活化及后续的细胞坏死发生。 结论：低氧能通过抑制细胞线粒体能量代谢、启动细胞自噬、阻断细胞内ROS产生、抑制JNK激酶活化等分子机制抑制TNFα诱导的SH-SY5Y细胞程序性坏死。
【关键词】：程序性坏死 低氧 ROS JNK 线粒体代谢
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329
【目录】：

• 缩略词表4-6
• 摘要6-10
• Abstract10-18
• 前言18-22
• 第一部分 TNF-α 诱导的 SH-SY5Y 细胞程序性坏死鉴定22-42
• 1. 实验材料22-24
• 2. 实验方法24-30
• 结果30-39
• 讨论39-42
• 第二部分 低氧拮抗 TNF-α 诱导程序性坏死的机制研究42-68
• 1. 材料和方法42-43
• 2. 实验方法43-47
• 结果47-64
• 讨论64-68
• 结论68-69
• 参考文献69-79
• 综述79-98
• 参考文献87-98
• 附录 实验使用溶液配方98-101
• 个人简历101-102
• 致谢102-103

【参考文献】

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1 ;Inducible nitric oxide synthase contributes to intermittent hypoxia against ischemia/reperfusion injury[J];Acta Pharmacologica Sinica;2005年03期

本文编号：1091382