利用同源模建对蛋白的抗原表位预测和抑制机理分析

发布时间：2017-11-01 20:29

  本文关键词：利用同源模建对蛋白的抗原表位预测和抑制机理分析

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【摘要】：蛋白质的三维结构信息对于研究蛋白质的功能及作用机制具有重要意义,但有些蛋白质的结晶难以获得,同源模建是解决这一难题的重要手段。与目的蛋白序列同源性大于30%、且已发表晶体结构的蛋白作为模板。利用同源模建技术构建目的蛋白三维结构,从而可以分析蛋白的活性口袋、特异性氨基酸与抑制机理等结构信息。本文主要针对3个不同来源的、且难以结晶的蛋白质酶为研究对象,利用同源模建分别获得它们的三维结构,分析了每个蛋白的特异三维结构信息。 (一)白眉蝮蛇降纤酶的同源模建及B细胞抗原表位预测 白眉蝮蛇降纤酶是临床上用来治疗血栓栓塞性疾病的国家基本药物,但该蛋白来源于蛇毒,是异源蛋白,且是分子量大于30KDa的大分子物质,具有免疫原性,能引起过敏反应。本文首先通过DNAStar软件和ABCpred、BCPREDS等服务器预测得到肽端AA27～35、44～50、66～72、79～98、101～109、117～127、134～142、151～164、179～188、194～206、221～233、247～260区域为白眉蝮蛇降纤酶的B细胞线性表位优势区域。然后以蝮蛇毒蛋白C激活剂蛋白的晶体结构为模板,利用MODELLER9.10软件中的Pythonwin程序进行白眉蝮蛇降纤酶的同源模建,并利用PROCHECK,ERRAT及PROSA程序进行同源模建的合理化评价。根据白眉蝮蛇降纤酶的模建三维结构并结合DiscoTope和cons PPISP网络数据库预测B细胞构象型抗原表位。得到蛋白的N端45～51、81～90、95～106、134～141、153～159、177～182、225～232、251～257区段为白眉蝮蛇降纤酶的B细胞构象型表位区域。 (二)黄曲霉果胶甲基酯酶的同源模建及其抑制机理分析 黄曲霉果胶甲基酯酶是黄曲霉侵染植物时分泌的关键酶,该酶被认为是植物致病因子之一。植物不分泌抑制该酶的活性物质,因此该酶的外源抑制剂的研发可成为抑制黄曲霉污染的有效手段。研究室前期研究发现绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯Epigallocatechin gallate (EGCG)对重组黄曲霉果胶甲基酯酶的活性有很强的抑制作用,而绿茶中的表没食子儿茶素(-)-epigallocatechin (EGC)对该酶的抑制效果不明显。为了更好地了解该酶的分子抑制机理,本文首先以西红柿果胶甲基酯酶的晶体结构为模板构建了黄曲霉果胶甲基酯酶的同源模建。分子对接发现EGCG能稳定地存在于酶的活性口袋里,是因为它可以与活性口袋处的氨基酸残基Gln122形成强氢键作用,还能与活性口袋处的氨基酸残基Trp228形成π-π堆积作用。另一方面,EGC只与不位于活性口袋的氨基酸残基发生氢键作用,因此不能覆盖酶的活性口袋。 (三)人来源趋化因子CCL1的重组制备、同源模建及抑制机理分析 趋化因子CCL1是炎症、肿瘤及神经性疼痛等疾病的关键因子,抑制其活性的化合物可以成为治疗这些疾病的候选药物。本文首先在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了人来源趋化因子CCL1,发现其形成包涵体。利用6M尿素将蛋白变性,通过亲和层析得到电泳纯度的重组人来源趋化因子CCL1。然后在含有还原型/氧化型谷胱甘肽的缓冲液中将蛋白复性。以趋化因子CCLl4的晶体结构为模板构建了CCL1的同源模建。通过分子对接和体外活性实验,筛选出实验室抑制剂编号为XL-10的小分子化合物具有很好的抑制效果。再通过分子对接发现,抑制剂XL-10可与CCL1的Asn30、Thr31和Ser32氨基酸残基形成氢键作用。
【关键词】：三维结构 同源模建 分子对接 重组蛋白 B细胞抗原表位 抑制机理
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 引言12-13
• 1 文献综述13-25
• 1.1 同源模建13-14
• 1.1.1 同源模建简介13
• 1.1.2 同源模建的基本步骤13-14
• 1.2 分子对接14-16
• 1.2.1 分子对接简介14-15
• 1.2.2 分子对接的基本步骤15-16
• 1.3 降纤酶及免疫原性16-19
• 1.3.1 降纤酶的临床应用及主要问题16
• 1.3.2 免疫原性16-19
• 1.4 果胶甲基酯酶19-21
• 1.4.1 果胶甲基酯酶概述19-20
• 1.4.2 黄曲霉果胶甲基酯酶抑制剂的研究意义20-21
• 1.5 趋化因子21-23
• 1.5.1 趋化因子简介21-22
• 1.5.2 趋化因子表达与纯化的研究进展22-23
• 1.5.3 趋化因子及其受体抑制剂的研究进展23
• 1.6 选题依据和研究内容23-25
• 1.6.1 选题依据23-24
• 1.6.2 研究内容24-25
• 2 白眉蝮蛇降纤酶的同源模建及B细胞抗原表位预测25-36
• 2.1 引言25-26
• 2.2 材料与方法26-27
• 2.2.1 降纤酶氨基酸序列选择26
• 2.2.2 白眉蝮蛇降纤酶的线性抗原表位预测26-27
• 2.2.3 序列比对和基因树27
• 2.2.4 白眉蝮蛇降纤酶的同源模建27
• 2.2.5 白眉蝮蛇降纤酶的构象型抗原表位预测27
• 2.3 结果与分析27-35
• 2.3.1 白眉蝮蛇降纤酶的氨基酸序列27-28
• 2.3.2 白眉蝮蛇降纤酶的二级结构及B细胞线性抗原表位的预测结果28-31
• 2.3.3 白眉蝮蛇降纤酶的同源模建结果31-33
• 2.3.4 白眉蝮蛇降纤酶的B细胞构象型抗原表位33-35
• 2.4 小结35-36
• 3 黄曲霉果胶甲基酯酶的同源模建及其抑制机理分析36-47
• 3.1 引言36-37
• 3.2 材料与方法37-39
• 3.2.1 黄曲霉果胶甲基酯酶的序列确定37
• 3.2.2 多重序列比对37
• 3.2.3 模型的能量最小化优化与评价37
• 3.2.4 分子对接37-39
• 3.3 结果与分析39-46
• 3.3.1 Blastp序列比对结果39-40
• 3.3.2 PROMAL 3D序列比对结果40-42
• 3.3.3 同源模建42
• 3.3.4 同源模建的评价42-44
• 3.3.5 抑制剂的分子对接结果44-46
• 3.4 小结46-47
• 4 人来源趋化因子CCL 1的重组制备、同源模建及抑制机理分析47-57
• 4.1 引言47
• 4.2 材料与方法47-50
• 4.2.1 实验材料47-48
• 4.2.2 pET-28a(+)-CCL1表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)48-49
• 4.2.3 重组人来源趋化因子CCL1的表达49
• 4.2.4 重组人来源趋化因子CCL1的分离纯化49
• 4.2.5 Western blotting49-50
• 4.2.6 重组人来源趋化因子CCL1的复性50
• 4.2.7 酶活力检测和抑制剂的筛选50
• 4.2.8 同源模建与分子对接50
• 4.3 结果与分析50-56
• 4.3.1 阳性克隆的筛选50-51
• 4.3.2 CCL1在大肠杆菌细胞中的表达51-52
• 4.3.3 人来源的趋化因子CCL1的分离纯化52
• 4.3.4 人来源趋化因子CCL1的同源模建52-53
• 4.3.5 人来源趋化因子CCL1抑制剂的筛选及抑制机理分析53-56
• 4.4 小结56-57
• 结论57-58
• 参考文献58-65
• 附录A 常用仪器一览表65-66
• 附录B 大肠杆菌转化66-67
• 附录C Western Blotting67-68
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况68-69
• 致谢69-70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 刘华;李敏;;基因重组蛋白质的表达系统与分离纯化研究进展[J];福建师范大学学报(自然科学版);2007年01期

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4 谌容;陈敏;杨春贤;廖志华;;基于SWISS-MODEL的蛋白质三维结构建模[J];生命的化学;2006年01期

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本文编号：1128423