小鼠皮肤来源干细胞向精子样细胞分化的研究

发布时间：2017-11-03 09:18

  本文关键词：小鼠皮肤来源干细胞向精子样细胞分化的研究

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【摘要】：近年来,男性不育患者约占我国育龄人口的10%,而40%以上的男性不育是由于精子发生异常造成的。虽然辅助生殖技术给许多患者带来了曙光,但是单靠辅助生殖和药物治疗还远远不够。利用皮肤来源干细胞向生殖细胞的定向分化可以在体外建立生殖细胞发生的模型并最终获得功能性配子,这对研究生殖细胞发生的调控机制以及治疗男性不育症等方面具有重要意义。本实验以小鼠为模型,诱导皮肤来源干细胞向精子分化,研究结果如下： 1、分离的新生小鼠皮肤经机械剪切和胰酶消化后,单细胞悬浮培养可获得球状克隆。这些皮肤来源干细胞(SDSCs)克隆经体外传代后,可检测到β-Integrin和Oct-4等干细胞特异性蛋白的表达。 2、SDSCs体外传代2次后吹打成单细胞,悬浮培养后形成拟胚体(Embryoid Body, EB)。将4天的EB消化成单细胞注射到免疫缺陷鼠的睾丸白膜下,一个月后可形成畸胎瘤,可向三个胚层分化,并形成三胚层典型的细胞类型。 3、EB消化成单细胞后与饲养层细胞共培养,并利用细胞因子诱导其向原始生殖细胞样细胞(Primordial Germ Cells-like Cells, PLCs)分化。在诱导的第4天,PLCs开始出现。经对早期生殖细胞特异的mRNA和蛋白检测发现,SDSCs分化来的PLCs与体内PGCs有着相似的生物学特性。 4、收集PLCs继续用精子发生培养液进行诱导分化。在诱导的第5天,这些细胞开始表达生殖细胞和精子的特异蛋白；体外诱导第13天时,经流式分析发现,SDSCs分化的单倍体生殖细胞的阳性率达到2.56%。 5、在PLCs分化的第6天,将miniMACS分选的SSEA-1阳性细胞注射到睾丸精细管中借助体内微环境进一步发育。组织学检测证实,移植的PLCs可在睾丸内存活并发育成精子样细胞。
【关键词】：皮肤来源干细胞 细胞分化 原始生殖细胞 精子样细胞
【学位授予单位】：青岛农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R321
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 前言10-11
• 第一部分 文献综述11-19
• 1 干细胞定义11-14
• 1.1 胚胎干细胞11
• 1.2 诱导多能性干细胞11-12
• 1.3 成体干细胞12-14
• 1.3.1 皮肤干细胞生物学特性12-13
• 1.3.2 皮肤干细胞的定位13-14
• 2 胚胎时期生殖细胞的体内发育14
• 3 生殖细胞体外培养14-15
• 4 不同类型干细胞体外向雄性配子分化15-18
• 4.1 胚胎干细胞向精子分化15-16
• 4.2 诱导多能性干细胞向精子分化16
• 4.3 成体干细胞向精子分化16-18
• 5 本实验研究意义18-19
• 第二部分 试验研究19-44
• 1 材料与方法19-31
• 1.1 实验材料19-21
• 1.2 实验方法21-30
• 1.3 统计方法30-31
• 2 结果与分析31-41
• 2.1 小鼠皮肤来源干细胞的分离培养及多能性检测31-32
• 2.2 小鼠皮肤来源干细胞体外形成拟胚体32-34
• 2.3 小鼠皮肤来源干细胞经拟胚体后具有多向分化的潜能34
• 2.4 小鼠皮肤来源干细胞体外向PLCs诱导及分析34-36
• 2.5 小鼠皮肤干细胞来源的PLCs体外向精子诱导分化及鉴定36-38
• 2.6 受体鼠的制备38-39
• 2.7 12.5dpc雄性生殖嵴miniMACS分选后体内移植及检测39-40
• 2.8 PLCs minMACS分选后体内移植及检测40-41
• 3 讨论41-44
• 3.1 皮肤干细胞向生殖细胞分化的优越性41
• 3.2 建立稳定高效的PLCs诱导体系41-42
• 3.3 体外诱导的精子样细胞功能性问题42
• 3.4 PLCs的分选对移植效率的影响42-43
• 3.5 受体鼠对移植效率的影响43-44
• 结论44-45
• 参考文献45-50
• 导师组意见50-51
• 致谢51-52
• 个人简介52-53
• 发表论文及专利53

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1 记者 郑颖t牎∥飧，

本文编号：1135573