细胞穿膜肽TAT与诱导多功能干细胞相关转录因子的融合表达及其穿膜能力研究

发布时间：2017-11-07 04:05

  本文关键词：细胞穿膜肽TAT与诱导多功能干细胞相关转录因子的融合表达及其穿膜能力研究

  更多相关文章： TAT iPS 包涵体 纯化

【摘要】：将外源基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc导入成体细胞使其重编程，产生具有类似于干细胞性质的诱导多功能干细胞（iPS）是近期干细胞研究的热点。然而基于病毒技术将外源基因插入细胞基因组存在致瘤的风险，因此制约iPS的临床应用。本文利用细胞穿膜肽TAT可高效介导蛋白进入细胞的特点，设计并制备了TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog融合蛋白，并评价了其穿透细胞能力，为获得更为安全的iPS奠定了基础。 首先扩增获得TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4目的基因，利用重叠PCR技术将细胞穿膜肽TAT与c-Myc、Nanog基因片段融合，获得TAT-c-Myc、TAT-Nanog目的基因。所有PCR产物经Nco I和Xho I双酶切，插入pET28a表达载体，构建相关的重组质粒经测序验证与理论序列一致。将重组质粒转入BL21(DE3)原核表达菌株，经SDS-PAGE鉴定后，，分别获得表达TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog的重组工程菌。 SDS-PAGE结果显示，TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog在大肠杆菌中主要以不溶性包涵体形式表达。包涵体在变性条件下利用镍柱纯化，最终产物纯度可达90%以上。采用添加精氨酸、甘油、GSH/GSSG等的尿素梯度透析复性方法获得具有活性的TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog目的蛋白，其平均复性收率分别为8.8%、51.0%、47.9%、67.2%、8.5%。 免疫荧光分析结果显示，5种带有细胞穿膜肽TAT的融合蛋白可穿透近100%受试细胞的细胞膜。同时确定TAT-Oct4、TAT-Sox2、TAT-Klf4、TAT-c-Myc和TAT-Nanog作用细胞的最佳浓度分别为6μg/mL、8μg/mL、8μg/mL、8μg/mL、4μg/mL。为了进一步分析各个蛋白在细胞内相对量，流式细胞仪分析结果显示，各个蛋白的荧光强度值分别为37.5、44.5、38.7、44.7、64.7，其相对荧光强度为16.6%、20.6%、17.3%、20.7%、33.2%。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416

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本文编号：1150744