NGF促进海马神经再生过程中Brn-4、Lhx8的表达变化

发布时间：2017-11-07 06:06

  本文关键词：NGF促进海马神经再生过程中Brn-4、Lhx8的表达变化

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【摘要】：目的：探讨NGF促进海马神经再生、神经干细胞向神经元和胆碱能神经元分化过程中,POU同源盒基因Brn-4和LIM同源盒基因Lhx8的表达变化,以及海马新生神经元过表达Lhx8后向胆碱能神经元分化的情况。 方法： 实验一：1.SD大鼠随机分为对照组、切割组、NGF组、NGF联合切割组,每组18只；切割组大鼠切割右侧穹窿海马伞,NGF组大鼠侧脑室注射NGF,NGF联合切割组在切割右侧穹窿海马伞的基础上侧脑室注射NGF；2.分离各组6只SD大鼠海马组织,提取总RNA,合成第一链cDNA, Real-time PCR检测Brn-4基因的表达变化；3.分离各组6只大鼠海马组织,提取总蛋白并定量,Western blot检测Brn-4蛋白的表达变化；4.各组6只SD大鼠灌注取脑、冰冻切片后,行Brn-4/BrdU/NeuN免疫荧光检测和Hoechst细胞核标记；5.体外培养海马神经干细胞,分为对照组、正常组(含5%正常海马提取液)、切割组(含5%切割侧海马提取液)、NGF组(含20ng/ml的NGF)、NGF+正常组(含20ng/ml的NGF和5%正常海马提取液)、NGF+切割组(含20ng/ml的NGF和5%切割侧海马提取液),培养7d：6.提取各组细胞的总RNA,合成第一链cDNA, Real-time PCR检测Brn-4基因表达变化；7.提取各组细胞总蛋白,Western blot检测Brn-4蛋白的表达变化；8.免疫荧光检测各组DCX/Brn-4双标神经元数；9.图像处理和统计学分析。 实验二：1.SD大鼠随机分为对照组、切割组、NGF组、NGF联合切割组,每组各18只：切割组大鼠切割右侧穹窿海马伞,NGF组大鼠侧脑室注射NGF,NGF联合切割组在切割右侧穹窿海马伞的基础上侧脑室注射NGF；2.分离各组6只海马组织,提取总RNA,合成第一链cDNA, Real-time PCR检测Lhx8基因的表达变化；3.分离各组6只大鼠海马组织,提取总蛋白, Western blot检测Lhx8蛋白的表达变化；4.各组6只SD大鼠灌注取脑、冰冻切片后,行ChAT/Lhx8免疫荧光检测和Hoechst细胞核标记：5.体外培养海马神经干细胞,分为对照组、正常组(含5%正常海马提取液)、切割组(含5%切割侧海马提取液)、NGF组(含50ng/ml的NGF)、NGF+正常组(含50ng/ml的NGF和5%正常海马提取液)、NGF+切割组(含50ng/ml的NGF和5%切割侧海马提取液),培养14d；6.提取各组细胞的总RNA,合成第一链cDNA, Real-time PCR检测Lhx8基因表达变化；7.提取各组细胞总蛋白,Western blot检测Lhx8蛋白的表达变化；8.免疫荧光检测各组ChAT/Lhx8双标神经元数；9.图像处理和统计学分析。 实验三：1.体外培养海马新生神经元分为对照组和转染组,分别加入阴性对照慢病毒和Lhx8过表达慢病毒,培养5d；2.提取两组细胞的总RNA,合成第一链cDNA, Real-time PCR检测Lhx8基因表达变化；3.提取两组细胞总蛋白,Western blot检测Lhx8蛋白的表达变化；4.免疫荧光检测两组细胞中EGFP/ChAT/VAChT三标神经元数；5.图像处理和统计学分析。 结果： 实验一：体内实验：1. Real-time PCR检测结果提示,NGF联合切割组中Brn-4的基因表达量较其他三组明显增高,差异具有统计学意义(P0.05)；2.Western blot检测结果提示,NGF组中Brn-4蛋白的表达量较对照组及切割组明显增高,差异具有统计学意义(P0.05); NGF联合切割组中Brn-4蛋白表达量较其他三组明显增高,差异具有统计学意义(P0.05或P0.01)；3.对照组海马齿状回颗粒下层及门区中仅见少量的Brn-4/BrdU/NeuN的三标细胞,切割组和NGF组中Brn-4/BrdU/NeuN三标的阳性细胞较对照组明显增多,差异具有统计学意义(P0.05或P0.01)；NGF联合切割组中的三标细胞增高更为明显,与其他三组比较差异具有统计学意义(P0.05,P0.01或P0.001)。体外细胞培养：1. Real-time PCR检测结果提示切割组、NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中Brn-4基因的表达量较对照组及正常组明显增高(P0.05),而上述四组之间无明显差异；2.Western blot结果提示,切割组、NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中Brn-4蛋白的表达量较对照组及正常组明显增高(P0.01)；NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中Brn-4蛋白的表达量较切割组明显增高(P0.05),但三组之间无明显差异；3.切割组、NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中DCX/Brn-4双标的阳性细胞数较对照组及正常组明显增多(P0.01或P0.001)；NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中DCX/Brn-4阳性细胞数又较切割组明显增多(P0.05或P0.01),而三组之间差异无统计学意义。 实验二：体内实验：1. Real-time PCR提示NGF组中Lhx8基因的表达量较正常组和切割组明显增高,差异具有统计学意义(P0.01); NGF联合切割组中Lhx8基因的表达量明显高于其他各组,差异具有统计学意义(P0.001)；2.Western blot结果提示切割组、NGF组、NGF联合切割组中Lhx8蛋白的表达量明显高于对照组(P0.05或P0.01)；NGF组和NGF联合切割组中Lhx8蛋白的表达量又高于切割组(P0.05)；3.对照组海马齿状回颗粒下层和门区中几乎检测不到ChAT/Lhx8双标细胞,切割组齿状回颗粒下层和门区中可检测到少量ChAT/Lhx8双标细胞；NGF组可检测到较多的ChAT/Lhx8双标细胞,与对照组及切割组比较明显增多(P0.001)；NGF联合切割组中ChAT/Lhx8双标细胞最多、明显高于其他三组(P0.05,P0.01或P0.001)。体外细胞培养：1.Real-time PCR检测结果提示切割组、NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中Lhx8基因的表达量较对照组及正常组明显增高(P0.05或P0.01),NGF+切割组中Lhx8基因的表达量明显高于NGF组OP0.05);2.Western blot结果提示切割组、NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中Lhx8蛋白的表达量较对照组及正常组明显增高(P0.05或P0.01); NGF+切割组中Lhx8蛋白的表达量较切割组明显增高(P0.05)；6.正常组、切割组、NGF组、NGF+正常组、NGF+切割组中ChAT/Lhx8双标细胞数均较对照组明显增多(P0.05,P0.001或P0.001):NGF+切割组中ChAT/Lhx8双标细胞数又较NGF组明显增多(P0.05),而与NGF+正常组比较无显著性差异。 实验三：1. Real-time PCR结果提示,转染组中Lhx8基因的表达水平较对照组明显增高,差异具有统计学意义(P0.05);2.Western blot结果提示,转染组中Lhx8的蛋白表达水平较对照组明显增高,差异具有统计学意义(P0.05)；3.对照组和转染组均有细胞表达EGFP以及胆碱能神经元标记物ChAT和VAChT,转染组中ChAT/VAChT双标的胆碱能神经元数目明显多于对照组,差异具有统计学意义(P0.001)。 结论： 1.侧脑室灌注NGF能够提高神经再生海马组织中Brn-4和Lhx8mRNA和蛋白的表达水平,并促进海马NSCs向神经元和胆碱能神经元分化；2.体外细胞培养中,NGF促进海马NSCs向神经元分化过程中Brn-4表达增高,向胆碱能神经元分化过程中Lhx8表达增高；3.海马新生神经元转染Lhx8基因使其过表达,可促进其向胆碱能神经元分化；4.Brn-4和Lhx8高表达与海马神经再生和胆碱能神经再生有关。
【学位授予单位】：南通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R33

【参考文献】

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1 董传明;金国华;秦建兵;田美玲;邹琳清;谭雪锋;朱蕙霞;;神经生长因子对穹窿海马伞切割后海马自体神经干细胞增殖和向神经元分化的影响[J];解剖学报;2007年06期

2 熊咏;田美玲;秦建兵;朱蕙霞;金国华;;NGF诱导大鼠胚脑皮层和隔区神经干细胞向神经元和AChE阳性神经元分化的作用[J];南通大学学报(医学版);2007年01期

3 赵善廷,邓锦波;大鼠海马结构的组成、细胞类型及神经纤维联系 Ⅰ.齿状回[J];神经解剖学杂志;1999年01期

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本文编号：1151144