富血小板血浆对大鼠脂肪来源干细胞体外增殖的影响

发布时间：2017-11-07 21:07

本文关键词：富血小板血浆对大鼠脂肪来源干细胞体外增殖的影响

【摘要】：目的：探索SD大鼠脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells， ADSCs）的分离与体外培养方法，观察其体外增殖特点、表型特征及定向分化能力。方法：从体质量约为120g的SD大鼠双侧腹股沟脂肪垫中分离出脂肪组织，采用Ⅰ型胶原酶消化法获取原代ADSCs，贴壁法纯化、传代，测定生长曲线。BD流式细胞仪检测第3代ADSCs表面标记。取第3代细胞用成脂诱导液诱导分化，用油红O染色鉴定。取第3代细胞用成骨诱导液诱导分化，并用Alizarin Red染色鉴定。结果：采用Ⅰ型胶原酶消化大鼠脂肪组织、贴壁法分离纯化能够得到纯度较高的ADSCs，，形态呈长梭形或多角形，体外扩增迅速，生长曲线呈S形。第3代ADSCs经流式细胞仪检测CD45、CD106呈阴性表达，CD90呈阳性表达。第3代ADSCs成脂诱导后，油红O染色细胞内脂滴明显；成骨诱导后，Alizarin Red染色细胞内钙化结节明显。结论：经SD大鼠腹股沟取材并分离纯化可以获得纯度较高的ADSCs，体外生长迅速，传代后能够进一步纯化并稳定增殖。ADSCs表达特定的表面分子且具备多向分化潜能，符合间充质干细胞的特征。目的：观察不同浓度富血小板血浆（PRP）对体外培养SD大鼠脂肪来源干细胞分裂增殖的影响，探讨合适作用浓度及作用机制，为PRP应用于临床脂肪移植提供实验依据。方法：1.采用二次离心法提取PRP，并应用其对ADSCs进行培养，实验分为对照组、未激活PRP组、激活PRP组（设立五个浓度梯度即1%PRP、5%PRP、10%PRP、15%PRP、20%PRP）。CCK-8法测定增殖情况，在培养后1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d，进行CCK-8测试，用酶标仪在450nm波长下检测各孔吸光度（A值）。测定结果显示PRP较为适宜的作用浓度为5%和10%组。2.DNA含量检测及细胞周期相关蛋白检测，实验分为空白对照组和实验组（10%PRP）。应用PI法，在培养后48小时，使用流式细胞仪检测ADSCs各组DNA含量变化；应用蛋白质印迹法（Western blot）测定ADSCs各组细胞周期素D1（cyclinD1）、p27Kip1的蛋白水平。结果：PRP处理前后，ADSCs形态没有明显改变。相差显微镜下见PRP组细胞增殖旺盛，胞浆丰富。激活后的各浓度PRP均能够提高ADSCs的增殖能力，PRP对ADSCs增殖的影响存在明显时间依赖性，在适宜浓度范围内，剂量依赖性明显，剂量过高则呈现抑制作用。DNA含量检测显示，经过10%浓度PRP处理ADSCs48h后，处于S期和G2/M期的细胞所占比例呈明显上升趋势，同时，处于G0/G1期的细胞所占比例呈明显下降趋势，即PRP能够促进ADSCs的细胞周期从G0/G1期进入S期。 Western blot显示，10%浓度PRP处理明显提高了ADSCs的cyclinD1和p27Kip1蛋白表达水平。结论：PRP能够促进大鼠ADSCs体外增殖，PRP通过改变DNA含量和细胞周期相关蛋白表达水平促进ADSCs体外增殖。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2

【参考文献】

中国期刊全文数据库前10条

1 朱艳霞;刘天庆;宋克东;姜丽丽;马学虎;崔占峰;;人脂肪组织来源干细胞生物学特性研究[J];大连理工大学学报;2010年05期

2 吴雷;柴志勇;杨转移;杨靓;陈若琨;方加胜;;脂肪基质干细胞移植对大鼠脑出血模型运动功能的影响[J];第四军医大学学报;2009年03期

3 赖宽;曾凡钦;郭庆;谭国珍;魏菁;李伯有;;异基因脂肪干细胞对系统性红斑狼疮患者Th17淋巴细胞亚群的调节[J];广东医学;2010年12期

4 邓春华;孙祥宙;高勇;罗道升;刘贵华;黄燕平;;大鼠脂肪组织来源干细胞的分离、培养和生物学特性的研究[J];中华男科学杂志;2008年02期

5 袁先道;闫曦;杨华;高志强;李康华;韩钦;卢姗;陈晓巍;亓放;姜鸿;赵春华;;人脂肪来源间充质干细胞植入受损耳蜗后定向归巢并分化为毛细胞样细胞[J];中国生物工程杂志;2010年08期

6 张云松;何井华;戴丽冰;黎庆梅;;富血小板血浆对血管内皮细胞增殖及血管形成的影响[J];实用医学杂志;2011年07期

7 瞿海龙;麻晓静;张冰;;干细胞治疗自身免疫性疾病和心脏疾患的研究进展[J];医学研究与教育;2011年02期

8 梁久龙;刘晓燕;陶凯;李霞;;兔脂肪来源干细胞在扩张皮瓣淤血模型中的应用[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年49期

9 秦义武;赵劲民;苏伟;李晓峰;刘伟;;大鼠脂肪源性干细胞的分离培养及鉴定[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年23期

10 黎洪棉;柳大烈;吴涛;赵培冉;梁双武;;早期应用富血小板血浆凝胶对自体脂肪组织移植存活率的影响[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年31期