延胡索酸水合酶（FH）和甲基化CpG结合蛋白1（MBD1）的多抗制备及其功能研究

发布时间：2017-11-08 20:32

  本文关键词：延胡索酸水合酶（FH）和甲基化CpG结合蛋白1（MBD1）的多抗制备及其功能研究

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【摘要】：目的：构建原核表达质粒pGEX-4T-2/FH(400-510),转化入大肠杆菌感受态BL21(DE3)中诱导表达GST-FH(400-510)融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫小鼠获得抗人FH抗体。免疫印迹验证该抗体的特异性并分析FH在脑、心和肝脏组织中的分布。通过免疫共沉淀实验研究FH的相互作用蛋白。构建原核表达质粒pGEX-4T-2/MBD1(383-455), pMAL-C5X/MBD1(227-300), pMAL-C5X/MBD1(1-70)并转化入大肠杆菌感受态BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白,以纯化融合蛋白作为抗原免疫小鼠获得抗小鼠MBD1抗体。免疫印迹验证该抗体的特异性,免疫共沉淀实验证明抗体的功能。 方法：(1)人FH蛋白片段的表达、纯化和多抗制备。软件分析人源FH基因,选择1200-1530bp位的碱基序列为目的基因,其编码的110个氨基酸具有很好的同源性和抗原性。以PCMV6-AC/FH为模版PCR扩增目的基因,将目的基因克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建重组质粒pGEX-4T-2/FH(400-510).重组质粒经PCR和测序鉴定后转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达。将诱导后的菌株进行破碎离心分离上清和沉淀,SDS-PAGE分析蛋白的存在状态。将上清用GST琼脂糖凝胶亲和层析纯化；沉淀采用8M的尿素变性、透析复性后用GST琼脂糖凝胶亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western-Blot分析和鉴定纯化蛋白,并用Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。用纯化的蛋白免疫小鼠,制备抗血清。 (2)验证抗体功能和寻找FH的相互作用蛋白。通过免疫印迹实验证明了该抗体的特异性并分析FH在大鼠的脑、心和肝组织中的分布情况。用自制抗体与小鼠的肝脏组织进行免疫共沉淀实验寻找FH的相互作用蛋白。将获得的蛋白进行蛋白质质谱分析。 (3)小鼠MBD1蛋白片段的表达纯化和多抗制备。依据MBD1结构分析选择MBD1的1-70aa、227-300aa、383-455aa三段肽段为抗原肽段。以PCMV6-AC/MBD1为模版,PCR获得三段目的基因。将目的基因分别克隆至表达载体pGEX-4T-2和pMAL-C5X上构建重组质粒pGEX-4T-2/MBD1(383-455)、pMAL-C5X/MBD1(227-300)和pMAL-C5X/MBD1(1-70)。重组质粒经PCR和测序鉴定后,再转化至表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达。亲和层析纯化融合蛋白并用western blot验证。将纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE,经考马斯亮蓝染色后,将目标蛋白条带切胶研碎与免疫佐剂共同免疫小鼠获得抗小鼠MBD1抗血清。将自制的抗血清通过western blot法分别识别人源和鼠源的MBD1,同时与小鼠的脑组织进行免疫共沉淀实验验证抗体的功能。 结果：(1)PCR扩增获得330bp的FH(400-510)目的基因,成功构建了重组质粒pGEX-4T-2/FH(400-510),经测序和PCR证实成功插入了目的基因。含pGEX-4T-2/FH(400-510)的DE3经IPTG诱导后,经亲和纯化获得融合蛋白GST-FH(400-510)。western blot验证纯化目标蛋白能被抗GST抗体识别,在分子量36KD处有特异性条带与预期的蛋白分子量相符。重组融合蛋白免疫小鼠获得抗FH抗体。 (2)Western-blot结果显示,大鼠来源的FH内源性蛋白能被自制的抗FH抗体识别,在55kDa附近有特异条带。FH在大鼠的心脏和肝脏中的含量远高于脑。质谱鉴定发现,FH的相互作用蛋白主要是一些参与三羧酸循环的酶及参与尿素循环的酶、线粒体上的转运载体蛋白和与细胞生长、迁移相关的蛋白。 (3)PCR扩增获得三段MBD1目的基因约210bp,成功构建了重组质粒pGEX-4T-2/MBD1(383-455), pMAL-C5X/MBD1(227-300),pMAL-C5X/MBD1(1-70),经测序和PCR证实成功插入了目的基因。含重组质粒的的DE3经IPTG诱导后,经亲和纯化获得融合蛋白GST-MBD1(383-455),MBP-MBD1(227-300), MBP-MBD1(1-70)。SDS-PAGE和Western-blot验证GST-MBD1(383-455)融合蛋白,在36kD特异条带与预期融合蛋白大小一致。在26KD附近存在一条带与GST标签大小一致。SDS-PAGE和Western-blot验证MBP-MBD1(227-300), MBP-MBD1(1-70)融合蛋白,在50KD附近有特异条带与预期融合蛋白大小一致。Western-blot结果显示：以MBP-MBD1(227-300)和GST-MBD1(383-455)为抗原制备的抗体能够识别人和鼠的MBD1,并且能够进行免疫共沉淀实验。 结论： (1)成功的构建了重组表达质粒,表达纯化得到了FH的融合蛋白GST-FH(400-510)和融合蛋白MBP-MBD1(227-300), MBP-MBD1(1-70), GST-MBD1(383-455)。 (2)表达纯化的融合蛋白能够刺激小鼠产生抗FH的和抗MBD1的多克隆抗体。 (3)制备的抗鼠的MBD1抗体能够很好的识别鼠源和人源的MBD1并能够应用于免疫共沉淀实验。 (4)FH大鼠的心脏和肝脏中含量比脑组织高。 (5)发现多个三羧酸循环和尿素循环中的酶可能与FH发生相互作用。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：1158729