Nodal信号通路NOMO1基因与胚胎心脏发育关系的研究

发布时间：2017-11-10 02:06

  本文关键词：Nodal信号通路NOMO1基因与胚胎心脏发育关系的研究

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【摘要】：NOMO1 (Nodal Modulator 1)基因定位于人染色体16p13.11区带,编码1222个氨基酸,分子量约130 KD,有研究表明NOMO编码的蛋白与Nicalin结合形成的复合蛋白,为内质网驻留的转膜蛋白,该复合物在一定程度上抑制Nodal信号通路,而Nodal信号通路在心脏发育及其他器官形成中至关重要[1,21。前期研究中,本研究小组应用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),分析室间隔缺损(ventricular septal defect, VSD)患者心室肌组织基因表达谱与正常人之间的差异,发现了551种差异表达基因。其中,NOMO1基因低表达于VSD患者的心室肌组织中,提示NOMO1基因可能与先天性心脏病(congenital heart disease, CHD)的发生有关[3]。本文为进一步分析NOMO1的功能,首先检测NOMO1基因在SD大鼠胚胎心脏发育过程中1mRNA表达变化及定位情况,其次拟以RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)沉默NOMO1的表达,以小鼠胚胎癌细胞株(P19细胞)为工具细胞开展体外研究,评价NOMO1表达沉默对心肌细胞分化的影响。分析NOMO1基因的功能及在心脏发生中的作用将可能有助于阐明CHD的病因,并有助于提高诊断及开发新的治疗策略,并探讨其在胚胎心脏发育的意义。第一部分NOMO1基因在大鼠胚胎心脏发育过程中的表达目的：检测NOMO1基因mRNA在SD大鼠胚胎心脏发育过程中表达丰度及定位变化,并分析其对胚胎心脏发育的意义。方法：24只孕鼠随机分为6组,每组4只,分别于妊娠12d(D12)、15d(D15)、 16d (D16)、17d (D17)、19d (D19)、21d (D21)时取出胎鼠,取其心脏,采用实时定量PCR(real-time qRT-PCR)技术检测心脏组织中NOMO1基因mRNA的表达丰度,并应用荧光原位杂交(FISH)技术对其进行定位分析。结果：在妊娠D12、D15、D16、D17、D19、D21的胚胎心脏中NOMO1基因mRNA均有表达,表达丰度且呈由弱到强再减弱趋势,表达高峰出现在D16；该基因主要表达于心外膜中,而在心肌层、心内膜、心瓣膜等处未见明显表达。结论：NOMO1基因mRNA的表达及定位随大鼠胚胎的心脏发育呈动态变化的趋势,可能与心脏发育相关。第二部分NOM O1基因表达沉默抑制P19细胞定向分化为心肌细胞目的：探讨NOMO1基因表达沉默对P19细胞定向分化为心肌细胞的影响,并分析其在胚胎心脏发育过程中的作用。方法：①构建小鼠NOMO1 pGPU6/GFP/Neo-shRNA干扰载体,同时设置质粒空载作为阴性对照,转染P19细胞,G418筛选稳定表达株后,以real-time qRT-PCR、Western Blot技术验证NOMO1在细胞中的mRNA表达及蛋白表达,以此评估NOMO1基因的干扰效率；②稳定表达株经1%DMSO诱导分化为心肌细胞,于细胞诱导分化D0、D6、D10天,在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化；采用real-time qRT-PCR、Western Blot技术检测Nodal信号通路相关基因Nodal、Cripto及Smad2基因mRNA及蛋白的表达；采用real-time qRT-PCR技术检测心肌标志基因CTnT及心肌特异转录因子Nkx2.5、GATA4、TBX5基因mRNA的表达,以此评估NOMO1与P19细胞向心肌细胞诱导分化的关系。结果：①DNOMO1干扰组(RNAi组)于P19细胞诱导分化D0、D6、D10天NOMO1 mRNA及蛋白水平表达均显著低于阴性对照组(NC组),且差异有统计学意义(p0.05),代表达到了很好的RNA干扰效率；②于倒置相差显微镜下观察发现诱导分化D5天时两组均可见一些细胞聚集成团样生长的胚胎样小体形成,两组无明显区别,D10天时NC组可见一些搏动的心肌样细胞形成,而在RNAi组却很难发现；与NC组比较,Nodal信号通路相关基因Nodal、Cripto及Smad2基因在RNAi组的mRNA及蛋白表达量于D0、D6、D10天均明显下降,且差异有统计学意义(p0.05),且与NC组随诱导分化过程中表达变化趋势是一致的；与NC组比较,CTnT、NKX2.5在RNAi组mRNA表达量在D6天略上调,而在D0天、D10天表达量明显下降,且差异有统计学意义(p0.05); GATA4于RNAi组与NC组比较mRNA 于D0、D6、D10天均明显下降,且差异有统计学意义；TBX5于RNAi组与NC组比较在DO天略上调,D6天、D10天表达量明显下降,且差异有统计学意义(p0.05),该四种基因mRNA的表达水平在RNAi组总体趋势是下降的。结论：NOMO1基因表达沉默抑制了P19细胞向心肌细胞诱导分化,与心脏发育密切相关。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R321.5

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本文编号：1164573