抑制线粒体MPTP开放对大鼠重要器官缺血缺氧损伤的保护作用及其机制研究

发布时间：2017-11-11 23:18

  本文关键词：抑制线粒体MPTP开放对大鼠重要器官缺血缺氧损伤的保护作用及其机制研究

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【摘要】：缺血缺氧是重要组织和器官最常见的致伤因素。创伤失血性休克是导致机体供血不足，组织缺血缺氧的常见原因之一。纠正休克后组织缺血缺氧的关键措施是恢复有效循环血量和微循环灌注，增加组织供氧。基础研究及临床资料证实单纯补液治疗并不能有效恢复失血性休克患者的组织器官氧供。因此，寻求有效的抗休克措施，改善缺血组织器官的供血状况是亟待研究和解决的问题。近年来，大量的文献报道线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)在细胞缺血缺氧性损伤过程中发挥着重要作用，与重要组织器官的缺血再灌注损伤以及神经系统病变有着密切的联系。环孢素A(cyclosporine A，CsA)可以抑制MPTP的开放，从而发挥对MPTP开放造成的组织细胞缺血性损害和氧化性损害的保护和治疗作用。但抑制MPTP能否对休克缺血缺氧所致组织器官损伤有保护作用，其机制如何，目前尚不清楚。血管功能(舒张/收缩功能)障碍是严重创伤/休克等临床重症常出现的一种心血管功能障碍，它严重影响着组织器官灌注，进而影响这些疾病的治疗。我们前期研究发现，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和Rho激酶(Rho associatedserine/threonine kinase，ROCK)是重要的调节休克后血管功能的激酶分子，在休克病理过程的发展和休克治疗中发挥重要作用。那么，MPTP关闭剂CsA能否通过改善休克后血管功能来改善组织灌注，发挥对器官功能的保护作用，其作用机制是否与PKC和ROCK有关，目前尚不清楚。据此，我们利用创伤失血性休克大鼠模型，研究CsA对休克后重要器官缺血缺氧损伤的保护作用及与血管功能的关系，并从PKC和ROCK途径初步探讨其机制。主要内容包括：CsA对休克动物的整体治疗效果，包括存活情况、血流动力学指标、血气指标；CsA对休克动物重要器官的保护作用，包括肝肾血流量、肝肾功能及组织线粒体功能；CsA对休克动物血管收缩/舒张功能的影响及与PKC和ROCK的关系。 主要实验方法： 第一部分抑制MPTP开放对大鼠缺血缺氧损伤的保护作用 采用创伤失血性休克模型(40mmHg，3h，伴左侧股骨折断)。动物分组情况为：正常对照组，无骨折、放血和给药处理；休克对照组，仅休克，不复苏；LR复苏组，在休克末给予2倍失血量的乳酸林格氏液(LR)；LR＋CsA1、5、10mg/kg组，分别将1、5、10mg/kg的CsA加入2倍失血量的LR进行输注。观察动物存活时间和24h存活率。在休克前、休克末(创伤失血性休克3h时)、复苏后1h、复苏后2h，观察大鼠血流动力学指标(MAP、HR、LVSP、LVEDP、±dp/dtmax)和血气(pH值、BE、乳酸、HCO_3~-、PaO_2、PaCO_2、SaO_2)的变化。在上述四个时相点将大鼠行剖腹手术，采用激光多谱勒组织血流量测定仪测量肝、肾血流量，抽血检测肝肾功能(ALT、AST、BUN、CREA)，随后处死大鼠，取肝脏、肾脏和小肠检测其线粒体功能。观察MPTP抑制剂CsA对休克大鼠血流动力学、血气、肝肾血流量、肝肾功能和线粒体功能的影响。 第二部分抑制MPTP开放对缺血缺氧血管功能的保护作用及其机制 血管环实验，实验分组包括正常对照组、休克对照组、LR复苏组、CsA1mg/kg组、CsA5mg/kg组、CsA10mg/kg组、CsA5mg/kg+ROCK激动剂U46619组、CsA5mg/kg+ROCK抑制剂Y27632组、CsA5mg/kg+PKC激动剂PMA组、CsA5mg/kg+PKC抑制剂Staurosporine组。实验模型和给药处理方法同第一部分。在复苏后将大鼠行剖腹手术，分离肠系膜上动脉(SMA)，利用离体血管环张力测定技术，观察MPTP关闭剂CsA对去甲肾上腺素(NE)诱导的休克大鼠肠系膜上动脉收缩反应和对乙酰胆碱(ACh)诱导的舒张反应的影响，以及PKC和ROCK在其中的作用。 细胞实验，采用培养的大鼠肠系膜动脉血管平滑肌细胞(VSMC)，观察ROCK激动剂和抑制剂对缺氧培养的VSMC的MPTP开放情况的影响，结合前面实验探讨ROCK和PKC是否参与了抑制MPTP开放所介导的缺血缺氧血管功能的保护作用。 主要结果： 1.与单纯乳酸林格氏液复苏相比，CsA(5mg/kg和10mg/kg)可明显提高创伤失血性休克大鼠的存活时间和24h存活率。休克处理24h后，正常对照组、休克对照组、LR组、CsA1mg/kg组、CsA5mg/kg组、CsA10mg/kg组的存活动物数分别为16/16、0/16、4/16、5/16、9/16、9/16。 2.休克后大鼠的血流动力学指标MAP、LVSP、±dp/dtmax和HR都显著降低。LR复苏可轻度改善血流动力学指标，但显著低于正常对照组；CsA(5mg/kg和10mg/kg)可明显升高MAP、LVSP和±dp/dtmax，在复苏2h时明显高于LR组(P0.05)，并接近正常水平；CsA1mg/kg也可使上述各项指标有所恢复，但与LR组相比无统计学差异。各剂量的CsA治疗组与LR组对休克大鼠的HR恢复情况没有显著性差异。各实验组大鼠在各时相点的LVEDP指标变化没有统计学意义。 3.休克后大鼠处于严重的酸碱平衡失调状态，血pH值、HCO_3~-、BE均显著下降，乳酸含量明显增高。不同剂量CsA输注可改善休克后的酸中毒状态，使血浆HCO_3~-、BE明显恢复，乳酸水平降低，CsA5mg/kg对血气指标的改善作用明显优于单纯给予LR复苏(P0.05或P0.01)。而在各时相点各实验组大鼠的SaO_2基本均处于正常范围，未出现有临床意义的改变。 4.创伤失血性休克后大鼠的肝、肾血流量明显低于正常水平，肝肾功能指标AST、ALT、BUN和CREA含量显著升高。经过复苏治疗2h后，CsA5mg/kg组的肝血流量明显高于休克对照组和LR组(P0.05)，各剂量CsA治疗组的肾血流量均高于休克对照组和LR组(P0.05或P0.01)。CsA1、5mg/kg组的ALT和CREA指标明显下降，低于LR组(P0.05或P0.01)。各复苏组的AST和BUN指标在复苏治疗前后未出现显著改善。 5.休克处理后，大鼠的肝、肾及小肠线粒体功能均明显下降。经过复苏治疗2h后，CsA5mg/kg组的肝线粒体功能以及CsA1、5mg/kg组的肾、小肠线粒体功能均明显恢复，接近正常水平，明显高于休克对照组和LR组(P0.05或P0.01)。 6.休克损伤使大鼠肠系膜上动脉对去甲肾上腺素(NE)诱导的收缩反应和对乙酰胆碱(ACh)诱导的舒张反应都明显降低，单用LR复苏仅轻度提升血管收缩和舒张功能，CsA输注可明显恢复休克大鼠的肠系膜动脉收缩/舒张功能(P0.05或P0.01)，其中5mg/kg的CsA效果最为明显。 7. ROCK的抑制剂Y27632可显著抑制CsA引起的休克血管收缩反应的增加，最大收缩张力较CsA组显著降低(P0.01)；ROCK的激动剂U46619可进一步增加CsA诱导的休克血管反应升高。PKC的激动剂PMA和抑制剂Staurosporine对CsA调节休克血管功能的作用无明显影响。 8.缺氧处理使VSMC的MPTP开放显著增加，ROCK的激动剂U46619处理可抑制缺氧后MPTP的开放(P0.05)，而ROCK的抑制剂Y27632处理使MPTP开放进一步增加。 结论： 1. MPTP关闭剂CsA对创伤失血性休克后缺血缺氧损伤有保护作用，可明显促进休克动物的血流动力学、血气、重要器官功能及血流量、线粒体功能的恢复，提高创伤失血性休克大鼠的存活率和存活时间。结果提示抑制MPTP开放有可能成为创伤失血性休克治疗的新策略。 2.休克导致了血管的收缩/舒张功能明显损伤，抑制MPTP可通过恢复休克后血管功能来改善组织血流灌注和器官功能，发挥对创伤休克的治疗作用，，初步结果提示其机制可能与ROCK调节MPTP开放有关。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

【参考文献】

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1 李涛;刘良明;杨光明;徐竞;明佳;刘建仓;;Rho-激酶在失血性休克大鼠血管低反应发生中的作用[J];创伤外科杂志;2006年02期

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3 ;Opioid receptor antagonists increase [Ca~(2+)]_i in rat arterial smooth muscle cells in hemorrhagic shock[J];Acta Pharmacologica Sinica;2004年03期

4 胡弋;李涛;徐竞;唐小唪;刘良明;;缺血预处理对失血性休克大鼠血管反应性及钙敏感性的影响[J];中国病理生理杂志;2011年03期

本文编号：1173310