酒精代谢关键酶的基因分型方法研究

发布时间：2017-11-12 12:09

  本文关键词：酒精代谢关键酶的基因分型方法研究

  更多相关文章： 乙醇脱氢酶2 乙醛脱氢酶2 单核苷酸多态性 基因分型

【摘要】：目的： 酒精（乙醇）在体内的代谢主要有赖于乙醇脱氢酶（2ADH2）、乙醛脱氢酶（2ALDH2）两种酶的催化，前者可将乙醇转化成乙醛，后者可将有毒、致癌的乙醛转化为无毒的乙酸。两种酶的编码基因各有一个严重影响酶活性的单核苷酸多态位点即ADH2基因G143A位点（rs1229984位点）、ALDH2基因G1510A位点（rs671位点），与个体的酒精代谢能力及酒精相关性疾病的发生密切相关。 本研究拟建立简便、快速、准确、经济的rs1229984及rs671位点的基因分型方法，以促进酒精代谢关键酶的基因分型工作在基层卫生部门的开展，便于民众从基因水平了解自己的酒精耐受性，从而合理、健康饮酒，降低酒精相关性疾病的发生。本研究还将对广东人群rs1229984及rs671位点的基因型、等位基因频率进行调查，以期为酒精相关性疾病的预防干预提供参考依据。 方法： 1.针对rs671位点的分型：以100例样品为研究对象，尝试如下五种方案，它们均以聚合酶链反应 限制性片段长度多态性（PCR RFLP）为基础，但在PCR模板的制备方法、PCR引物的设计修饰、快速限制性核酸内切酶的选用、酶切产物的电泳检测等方面存在一定差异： (1)方案一：以提纯的口腔拭子基因组DNA为模板，用与模板完全配对的一对引物F1、R1扩增跨越rs671位点的片段，PCR产物理论长度为535bp，野生型等位基因ALDH2*1（G1510）的PCR产物在多态位点含有限制性核酸内切酶TspRⅠ识别位点（NNCASTGNN↓)，突变型等位基因ALDH2*2（A1510）的PCR产物在多态位点不含TspRⅠ识别位点，此外，两者均在多态位点下游含有1个TspRⅠ识别位点。用快速限制性核酸内切酶TspRⅠ于65℃酶切消化PCR产物5min，用4.0%琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，根椐限制性酶切图谱确定每份样品的基因型。3种基因型的判断依据为：野生型纯合子ALDH2*1/ALDH2*1（GG）的条带为255、150.5、129.5bp；突变型纯合子ALDH2*2/ALDH2*2（AA）的条带为405.5、129.5bp；杂合子ALDH2*1/ALDH2*2（GA）的条带为405.5、255、150.5、129.5bp。 (2)方案二：除PCR模板为口腔拭子粗处理液外，余者与方案一相同。 (3)方案三：以口腔拭子粗处理液为模板，通过半巢氏PCR扩增跨越rs671位点的靶片段。第一轮PCR所用引物与方案1完全一致，即F1、R1，第2轮PCR的下游引物R1保持不变，上游内引物F2与模板完全配对，扩增产物为467bp，野生型等位基因ALDH2*1（G1510）的PCR产物在多态位点含有限制性核酸内切TspRⅠ(NNCASTGNN↓)识别位点，突变型等位基因ALDH2*2（A1510）的PCR产物在多态位点不含TspRⅠ识别位点，此外，两者均在多态位点下游含有1个TspRⅠ识别位点。用快速限制性核酸内切酶TspRⅠ于65℃酶切消化PCR产物5min，用4.0%琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段制作限制性酶切图谱。3种基因型的判断依据为：野生型纯合子GG的条带为255、129.5、82.5bp；突变型纯合子AA的条带为337.5、129.5bp；杂合子GA的条带为337.5、255、129.5、82.5bp。 (4)方案四：以口腔拭子粗处理液为模板，用巢氏PCR扩增靶片段，其中第1轮PCR引物为与模板完全配对的引物F4、R1，第2轮引物采用F3、R3,其中F3与模板完全配对，R3为长达56nt的引物【该引物靠近3′端倒数第3、第4个碱基与模板错配，以在野生型等位基因的多态位点附近引入HinfⅠ（GA↓NTC）识别位点，此外还在引物5’端增加了1个33nt的接头以增加后续酶切分型的分辨率】。扩增产物理论长度为372bp，野生型等位基因ALDH2*1的PCR产物在多态位点含有限制性核酸内切酶HinfⅠ识别位点，突变型等位基因ALDH2*2的PCR产物在多态位点不含HinfⅠ识别位点，此外，两者均在多态位点上游含有1个HinfⅠ识别位点。用快速限制性核酸内切酶HinfⅠ于37℃酶切消化PCR产物5min，用4.0%的琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段判定基因型，3种基因型的判断依据为：野生型纯合子GG的条带为236、81.5、54.5bp；突变型纯合子AA的条带为290.5、81.5bp；杂合子GA的条带为290.5、236、81.5、54.5bp。 (5)方案五：以提纯的口腔拭子基因组DNA为模板，PCR引物为方案四中所用第2轮引物F3、R3，扩增的靶片段理论长度也为372bp，用快速限制性核酸内切酶HinfⅠ于37℃酶切消化PCR产物5min，用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切片段，经银染显示限制性酶切图谱，基因型的判断依据方案四。 2.以筛查出的ALDH2*1/*1、ALDH2*2/*2基因型样品为模板，通过T A克隆构建含ALDH2*1、ALDH2*2等位基因的重组质粒，并测序加以验证。3.针对rs1229984的分型：以100例样品的粗处理液为模板，用半巢氏PCR扩增靶片段，其中第1轮PCR引物为F5、R6，它们与模板完全配对，第2轮PCR引物采用F6、R6，F6为长达59nt的引物【该引物靠近3′端倒数第2个碱基与模板错配，以在野生型等位基因的多态位点附近引入限制性核酸内切酶HhaⅠ（GC↓GC）识别位点，此外还在引物5’端增加了1个39nt的接头以增加后续酶切分型的分辨率】。扩增产物理论长度为393bp，野生型等位基因ADH2*1（G143）的PCR产物在多态位点含有HhaⅠ识别位点，突变型等位基因ADH2*2（A143）的PCR产物在多态位点不含HhaⅠ识别位点，此外，两者均在多态位点下游含有1个HhaⅠ识别位点。用快速限制性核酸内切酶HhaⅠ于37℃酶切消化PCR产物5min，用4.0%的琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段判定基因型，突变型型纯合子AA的条带为286、107bp；野生型纯合子GG的条带为227、107、59bp；杂合子GA的条带为286、227、107、59bp。 4.采用上述建立的巢式PCR RFLP和半巢式PCR RFLP法，分别对346例广东人的样品进行rs671、rs1229984位点的分型，统计相应的基因频率和基因型频率，通过Hardy Weinberg遗传平衡检测分析样本是否具有群体代表性，应用统计学软件SPSS v19.0分析广东人群rs671、rs1229984位点的分布频率是否与其它地区人群存在差异。 结果： 1.五种基于PCR RFLP的ALDH2基因G1510A位点（rs671位点）分型方法，每种方法都能在PCR阶段获得预期大小的靶片段，PCR产物的酶切消化均在10分钟内完成，制作的限制性酶切图谱都非常清晰且符合理论预期；对同一批样品（100例）进行的分型实验，显示五种方法的分型结果完全一致；每种方法均随机抽取3种基因型样品进行测序验证，结果完全正确。 2.PCR及测序证实ALDH2*1（野生型等位基因）、ALDH2*2（突变型等位基因）已成功克隆到pMD18 T载体上。 3.建立了一种ADH2基因G143A位点（rs1229984位点）快速分型方法，，对100例样品进行分型，PCR结果清晰，酶切结果符合预期，随机抽取的3种基因型样品测序结果同所建立方法的分型结果完全一致。 4.对来自广东人群的346例样品（男181例、女165例）进行ALDH2基因G1510A位点的分型，结果显示，ALDH2*1/*1、ALDH2*1/*2、ALDH2*2/*2三种基因型的频率分别为0.51、0.44、0.05；等位基因G（ALDH2*1）的频率为0.727，等位基因A（ALDH2*2）的频率为0.273。经Hardy Weinberg遗传平衡检验,2=3.40, P=0.182，说明样本具有群体代表性。 对上述346例样品进行ADH2基因G143A位点的分型，结果显示，ADH2*1/*1、ADH2*1/*2、ADH2*2/*2三种基因型的频率分别为0.10、0.47、0.43；等位基因G （ADH2*1）的频率为0.34，等位基因A （ADH2*2）的频率为0.66。经Hardy Weinberg遗传平衡检验,2=0.88,P=0.644（P0.05)，说明样本具有群体代表性。 5. rs1229984、rs671两个位点在广东人群的9种基因型组合ADH2(GG)/ALDH2(GG)、ADH2(GG)/ALDH2(GA)、 ADH2(GG)/ALDH2(AA)、 ADH2(GA)/ALDH2(GG)、ADH2(GA)/ALDH2(GA)、 ADH2(GA)/ALDH2(AA)、 ADH2(AA)/ALDH2(GG)、ADH2(AA)/ALDH2(GA)、ADH2(AA)/ALDH2(AA)，频率分别为：0.052、0.043、0.006、0.272、0.176、0.02、0.185、0.217、0.029 6.针对rs671位点，广东人群与云南人群的基因型频率的卡方检验结果，2值为8.893,P大于0.005，表示无显著性差异；等位基因分布2值为7.943，P小于0.005，表明有显著性差异；与洛阳、湖南、四川人群的基因型分布频率的卡方检验结果，其基因型频数卡方值分别为15.043、61.618、16.619，P值均小于0.005；其等位基因分布频数卡方值分别为13.760、25.531、15.293，且P值均小于0.005，表明有显著性差异。 针对ADH2基因rs1229984位点，广东人群与泰兴人群的基因型频率卡方检验结果2值分别为0.891，P值为0.640(p0.005)，表示无显著性差异；与云南、洛阳、鄂伦春族人群的基因型分布频率卡方检验结果，其基因型频数卡方值分别为13.174、11.503、54.444，P值均小于0.005,表明有显著性差异。广东人群与洛阳、泰兴人群等位基因型频率卡方检验结果2值分别为6.111，0.697，P值分别为0.013，0.404(p0.005)，表示无显著性差异；与云南、鄂伦春族人群的基因型分布频率卡方检验结果，其基因型频数卡方值分别为12.147、52.501，P值均小于0.005,表明有显著性差异。 结论： 1.针对ALDH2基因G1510A位点（rs671位点），成功建立了5种基于PCR RFLP的分型方法。PCR RFLP法为经典的基因分型方法，本身具有简便性。本研究中，每种方法都在PCR产物的多态位点外含有1个对照酶切位点，可避免各种因素造成的酶切不完全所导致的结果误判，保证了结果的准确性；每种方法都采用了可在5 10分钟内完成酶切的快速内切酶，从而大大降低了分型的时间。整个分型的时间从3h～5h30min不等，分型的成本介于2.5 15.0元之间，方法具有快速、经济性。 2.成功构建了pMD18 T ALDH2*1、pMD18 T ALDH2*2重组质粒，可作为rs671位点分型的对照品，为开发rs671位点分型试剂盒奠定了基础。 3.成功建立了半巢式PCR RFLP法检测ADH2基因G143A位点（rs1229984位点）的方法，PCR产物中同样含有对照酶切位点以保证分型的准确性，整个分型工作可在3h左右完成，成本3元左右。 4.广东人群男性、女性之间rs671位点的基因频率分布无显著性差异（卡方值为2.700，P值为0.259）；rs1229984位点的基因频率分布也无显著性差异（卡方值为1.814，P值为0.404）。 5.广东人群携带酒精性相关疾病高风险ALDH2*2等位基因者（即ALDH2*1/*2、ALDH2*2/*2基因型总和）高达49.0%。 6.对rs671位点的基因型频率分布分析，广东人群与云南人群无显著性差异，广东人群与洛阳、湖南、四川人群有显著性差异。等位基因频率分布分析，广东人群与云南洛阳、湖南、四川人群有显著性差异。 对rs1229984位点的基因型频率分布分析，广东人群与泰兴人群无显著性差异，与云南、洛阳、鄂伦春族人群有显著性差异；等位基因频率分布分析，广东人群与洛阳、泰兴人群无显著性差异，与云南、鄂伦春族人群有显著性差异。
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 曹海霞,丁建华,吴建中,高长明,李苏平,周建农,苏平,刘燕婷,周学富,王如鸿,丁保国;泰兴汉族人乙醇脱氢酶Ⅱ基因型分布及其与饮酒习惯的关系[J];癌变.畸变.突变;2005年05期

2 曾芳芳;刘盛元;王滨有;;乙醇脱氢酶基因多态性与饮酒行为及所致相关疾病的研究进展[J];疾病控制杂志;2008年02期

3 闫晨霞;赵钢涛;杨凡;丁媛媛;白旭朋;许景峰;;焦磷酸测序法检测外周血白细胞乙醛脱氢酶基因多态性[J];解放军药学学报;2010年01期

4 翟红梅;肖颖;肖霄;李晶;谷维娜;任蕾;;酒在人体内的代谢及酒精中毒[J];石家庄学院学报;2010年03期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 谭峥;乙醛脱氢酶2活性水平及基因型与冠心病的相关性研究[D];河北医科大学;2013年

本文编号：1175830