弓形虫GRA7分泌蛋白与宿主组分的相互作用研究

发布时间：2017-11-13 01:23

  本文关键词：弓形虫GRA7分泌蛋白与宿主组分的相互作用研究

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【摘要】：目的：刚地弓形虫RH株速殖子致密颗粒蛋白GRA7-GST-His融合蛋白的原核克隆表达，评价该蛋白的抗原性，研究弓形虫GRA7分泌蛋白与宿主组分的相互作用，为今后研究弓形虫感染免疫机理、弓形虫的治疗奠定基础。 方法：在体外用Hela细胞系培养弓形虫速殖子，利用梯度密度离心法和Percoll细胞分离液分离纯化速殖子。提取弓形虫总RNA，反转录获得cDNA，PCR扩增GRA7基因全长，与pET-41Ek/LIC载体通过基因重组直接连接，在大肠杆菌RosettaTM (DE3) pLysS工程菌中IPTG诱导表达重组融合蛋白，并用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱分离纯化带有His标签的蛋白，采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白产物。制备该纯化蛋白的小鼠免疫血清，用人弓形虫抗血清和小鼠免疫血清鉴定该蛋白的免疫原性。将THP-1细胞培养的弓形虫速殖子刺激分化单核巨噬细胞（THP-1），收集细胞裂解液进行GST pull-down实验，并将抓取的蛋白物质进行液相色谱和两级质谱联用技术（LC-MS/MS）进行蛋白鉴定。将鉴定后的细胞蛋白碳酸酐酶CA进行克隆表达纯化后制备小鼠免疫血清，用于Co-IP实验验证体内蛋白互作。在THP-1细胞系中瞬时转染pcDNA3.1-CA质粒过表达碳酸酐酶CA，观察碳酸酐酶CA对弓形虫生长的影响。 结果：GRA7重组蛋白与人源弓形虫患者血清、小鼠免疫血清免疫杂交表明克隆表达的GRA7蛋白抗原性较高。通过GST pull-down和Co-IP实验证实弓形虫GRA7分泌蛋白与宿主碳酸代谢酶类有显著蛋白互作。过表达碳酸酐酶CA和对照组相比，，实验组的弓形虫速殖子的出虫速度显著提高，最终出虫数量基本相同。 结论：大肠杆菌原核表达的弓形虫GRA7蛋白具有较好的抗原性，可为弓形虫临床免疫诊断试剂制备提供依据。宿主细胞碳酸代谢酶类被弓形虫GRA7分泌蛋白识别作用后直接或间接参与弓形虫的细胞内繁殖过程，可能与纳虫泡的形成和稳定性有关。
【学位授予单位】：首都医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R382.5

【参考文献】

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本文编号：1178494