狂犬病病毒不同毒株的生物学特性和狂犬病暴露后免疫动物模型研究

发布时间：2017-11-13 16:22

  本文关键词：狂犬病病毒不同毒株的生物学特性和狂犬病暴露后免疫动物模型研究

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【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患病，通常由感染了狂犬病病毒的疯动物咬伤或抓伤而感染人，目前尚无有效的治疗方法，死亡率为100%。狂犬病疫苗是控制人和动物狂犬病的关键因素之一。目前世界上用于人用及兽用狂犬病疫苗生产的毒株种类较多。对于各毒株的生物学特性，尤其是其致病性和对细胞的感染性目前缺乏较为系统的研究。本研究选取2株标准攻击毒（CVS、CVS-11）和4株疫苗株（PV、4aG、Flury-LEP、CTN-1）共6株狂犬病病毒固定毒，着重研究这6株固定毒对动物的致病性和对细胞的感染性。实验以小鼠脑内和肌肉途径接种比较不同毒株的致病性；研究并建立HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)诱导的空斑形成技术测定病毒空斑形成单位（Plaque-forming Unit，PFU）和细胞病变感染技术测定病毒感染滴度（CCID50），并用以比较不同毒株的病毒滴度，空斑实验及细胞病变实验同时在Vero及BHK-21细胞上进行，以确定敏感的细胞系；实验同时以常规的直接免疫荧光法（Direct ImmunofluorescentAssay，dFA）测定的FFU作为滴度参考值。 结果显示不同固定毒株对10-12g小鼠的脑内致病力普遍很高，但肌肉毒力普遍降低，相差在3.0-5.0lgLD50之间。用二种新的方法（PFU和CCID50）测定不同毒株的病毒滴度与dFA法测定的结果比较除个别株外无明显差别，如CVS-11、4aG、PV株用三种方法测定的滴度均在7.1-7.9lg之间。 实验表明用dFA法测定病毒滴度的结果与小鼠脑内测定的结果有可比性，用以替代小鼠脑内法测定疫苗原液内病毒滴度是可行的。二种细胞感染法更适宜采用BHK-21细胞，二种方法测定的病毒滴度操作简便，无需贵重仪器和昂贵试剂，可以更广泛地应用于狂犬病病毒和疫苗发展的研究，，也这为狂犬病病毒致病力研究及疫苗的质量控制研究奠定基础。 本文对金黄地鼠作为狂犬病暴露后免疫动物模型的可行性进行了研究，比较狂犬病固定毒CVS和CTN-1株对不同日龄地鼠和不同日龄小鼠肌内感染后的致病性，以及CVS株感染金黄地鼠后病毒入脑和和抗体应答动态。结果显示地鼠肌内感染病毒后7天左右出现狂犬病临床症状，其引起死亡的致病力较小鼠高（地鼠：6.4-8.0lgLD50/ml，小鼠：3.4-6.5lgLD50/ml），3周龄和8周龄金黄地鼠的敏感性无差异。病毒肌肉感染后约5-6天病毒进入脑内，用dFA可见脑组织的特异性荧光。感染后6-7天血清内开始出现中和抗体。根据以上特性选用8周龄地鼠作为狂犬病暴露后免疫动物模型进行疫苗的保护效果实验。 以金黄地鼠为动物模型，评价人用狂犬病疫苗、疫苗加PIKA佐剂、减毒活疫苗及人狂犬病免疫球蛋白在暴露后免疫中的保护效果；研究体液免疫在暴露后免疫中的作用，及其与保护效果的相关性。将CVS株稀释至4.0MICLD50/ml，感染8周龄的雌性金黄地鼠的左腿腓肠肌，6h后给予首次暴露后免疫，按照设计的免疫程序依次免疫，观察记录动物发病死亡情况。通过心脏穿刺连续采集给予暴露后免疫及感染对照组的血液，分离血清，RFFIT法测定血清抗体。结果表明未免疫的感染对照组的死亡率在90%左右，人用狂犬病疫苗的免疫保护力在70%以上，但疫苗稀释1-5倍后保护效果下降至20%-30%。同时在疫苗与PIKA佐剂相同1:4稀释后保护作用可达50%-90%，在联合使用疫苗及免疫球蛋白的条件下暴露后保护率可达100%。血清中的抗狂犬病病毒特异性中和抗体的检测结果表明暴露后免疫组的血清抗体可在第4天出现阳转，第5天达到100%阳转，以后持续维持较高水平，但未感染的暴露前免疫的动物的抗体水平从第4天开始一直较前者低，但是个体的抗体阳转与最终发病死亡无相关性。 本研究的实验表明金黄地鼠适用于作为狂犬病暴露后免疫的动物模型。对疫苗的评价结果显示人用狂犬病疫苗的效价在暴露后免疫中的保护作用关系很大，同时联合使用免疫球蛋白抗体注射至关重要，PIKA佐剂可以明显降低疫苗抗原量的同时提高保护作用，但暴露后免疫4天以后的抗体水平与保护作用无明显相关，其他免疫机制在暴露后免疫中的作用有待进一步深入研究。
【学位授予单位】：中国食品药品检定研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392

【参考文献】

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1 邹剑;俞永新;;狂犬病病毒减毒株的研究及应用进展[J];中国人兽共患病学报;2012年03期

本文编号：1181455