REGγ在氧化蛋白降解中的作用及其相关靶蛋白研究
本文关键词：REGγ在氧化蛋白降解中的作用及其相关靶蛋白研究
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【摘要】：氧化应激会引起细胞内蛋白质受到氧化损伤,影响细胞的正常生理功能,与神经退行性疾病、衰老等疾病的发生发展都密切相关。细胞内一些重要调控蛋白(如p21)的氧化损伤极易引起细胞功能紊乱,具有重要生物学功能的血红蛋白也是容易受到氧化损伤的蛋白质。所以,氧化损伤蛋白的清除对生命活动的正常运行至关重要。蛋白酶体系统在应答氧化应激方面起着重要的作用,它参与损伤蛋白质的清除,进而降低氧化蛋白质对细胞的毒副作用。本研究证明了一种11S蛋白酶体激活因子-REGγ参与调控氧化损伤蛋白p21的降解,并初步探究了REGγ对血红蛋白的调控。我们用H202(过氧化氢)处理HeLa和H1299细胞,发现氧化刺激会使p21的降解速度快于正常情况下的降解,而p21的mRNA水平在蛋白迅速被降解的期间没有变化。在REGγ稳定敲除的稳定细胞系(HeLashR)和REGγ未被敲除的对照组细胞(HeLa shN)中,我们验证了REGγ参与对氧化p21的降解具有促进作用。我们分别用不同刺激强度的H2O2(250μM,2mM)和苯肼(5mM,20mM)处理细胞,证明了氧化p21在shN细胞系中的被降解速度比在shR细胞系中快。同时,我们用H202处理A549 shNshR、HepG2、shNshR和MEF REGy+/-RECγ-/-,都得到了与HeLa shNshR相一致的结果,证明了REGγ对氧化p21降解促进作用在多种细胞中具有一致性。在用抗氧化剂NAC的预处理的细胞检测氧化应答实验中,证明了氧化损伤蛋白的降解依赖于底物蛋白的氧化还原性。在氧化降解机制方面,我们发现氧化p21的降解是依赖于蛋白酶体的,并且H2O2对细胞的的氧化刺激会使REGγ诱导的蛋白酶体trypsin-like (类胰蛋白酶)酶位点的活性升高,同时氧化刺激使REGy与20S的互做增强,进而REGγ蛋白酶体量增多,这一系列分子变化在一定程度上解释了REGy在促进氧化损伤p21降解中的作用。在质谱分析REGγ靶蛋白时,发现REGγ与血红蛋白亚基δ(HBD)可能存在相互作用,同时有文献报道,氧化损伤血红蛋白在没有ATP的情况下能被20S蛋白酶降解。我们构建了HBD的质粒,转入HeLa细胞中,同时过表达野生型REGγ(REGγ wt)或无功能型REGγ(REGγN151γ),发现野生型REGy的过表达会使HBD蛋白水平下调,无功能REGγ的过表达会使HBD蛋白水平上调。在免疫荧光实验结果中也再次证实了无功REGγ的过表达会使HBD蛋白水平上调,并且HBD与REGγ具有共定位现象。在过表达HBD的shN和shR细胞系中,我们发现REGγ能促进氧化刺激下HBD的降解。同时,我们检测了年轻小鼠中血红蛋白相关组织-骨髓、肝脏和脾脏中血红蛋白的表达量,发现REGy敲除小鼠组织中的血红蛋白水平高于野生型小鼠,与HBD有相似的结果。这些结果表明REGγ肯定对某些血红蛋白亚基有直接或间接的调控,但对于REGγ如何调控血红蛋白的机制还需进一步研究。上述研究证明了REGγ通过调节蛋白酶体活性来影响氧化损伤蛋白质的讲解。REGγ对氧化损伤蛋白的调节为研究氧化损伤机制提供了新的研究方向和模型,为衰老和氧化相关神经性疾病提供了一定的分子理论基础。REGγ对血红蛋白的调节也为研究血红蛋白相关疾病的发生发展提供了理论依据。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
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