UCH-L3基因真核表达质粒的构建及其在雷帕霉素诱导的NCI-H460细胞自噬中的作用的研究

发布时间：2017-11-18 13:22

  本文关键词：UCH-L3基因真核表达质粒的构建及其在雷帕霉素诱导的NCI-H460细胞自噬中的作用的研究

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【摘要】：目的：本研究通过构建UCH-L3真核表达质粒,转染NCI-H460细胞,并且加入雷帕霉素诱导NCI-H460细胞自噬,分别检测未转染组、转染质粒pcDN A3.1(+)-UCH-L3-EGFP组及转染质粒pcDNA3.1(+)-EGFP组NCI-H460细胞中LC3-Ⅱ蛋白和UCH-L3蛋白表达的改变,进一步探讨UCH-L3在雷帕霉素诱导的NCI-H460细胞自噬中的作用。 方法： 1.UCH-L3真核表达质粒的构建：培养NCI-H460细胞,运用RT-PCR技术获取人类UCH-L3基因片段,运用双酶切、基因克隆等技术将目的基因片段克隆入质粒pcDNA3.1(+)-EGFP,构建pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP真核表达质粒并采用双酶切及测序方法进行鉴定。 2.将实验分为未转染组、pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP组及pcDNA3.1(+)-EGFP组,采用阳离子脂质体方法转染NCI-H460细胞,转染48h后,于荧光倒置显微镜下观察EGFP表达阳性细胞所占的比例,评估转染效率。重复以上转染过程并于转染24h后使用实时荧光定量PCR方法检测UCH-L3基因mRNA表达情况。 3.western blot方法检测UCH-L3和LC3-Ⅱ蛋白表达水平：实验分为不加药+未转染组、不加药+pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP组、不加药+pcDNA3.1(+)-EGFP组、加药+未转染组、加药+pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP组、加药+pcDNA3.1(+)-EGFP组,按照分组进行转染及雷帕霉素处理,收集各组细胞并提取总蛋白,采用western blot方法分别检测各组中LC3-Ⅱ蛋白和UCH-L3蛋白表达水平。 结果： 1.UCH-L3真核表达质粒的构建：经双酶切、基因测序等方法证实pcDN A3.1(+)-UCH-L3-EGFP真核表达质粒构建成功。 2.转染48h后,将6孔板置于倒置荧光显微镜下,可见有绿色荧光蛋白表达阳性的细胞,阳性表达的细胞数约占总细胞数的50～60%。实时定量PCR方法检测3组UCH-L3基因mRNA的表达,结果显示：与未转染组及pcDNA3.1(+)-EGFP组相比,pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP组的UCH-L3基因mRNA的表达显著升高(P0.05),差异有统计学意义；pcDNA3.1(+)-EGFP组与未转染组相比UCH-L3基因mRNA的表达无显著差异(P0.05)。 3.western blot方法检测LC3-Ⅱ和UCH.L3蛋白表达水平： (1)与不加药各组相比,加药后各组的LC3-Ⅱ蛋白表达都明显增加,UCH.L3表达减少(P0.05),差异有统计学意义； (2)未加药或加药各组中,pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP组由UCH.L3蛋白表达量明显高于未转染组及pcDNA3.1(+)-EGFP组(P0.05),差异有统计学意义,未转染组及pcDNA3.1(+)-EGFP组相比差异无统计学意义(P0.05)； (3)加药各组中,pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP组与未转染组及pcDNA3.1(+)-EGFP组相比,可见LC3-Ⅱ蛋白表达减少(P0.05),未转染组及pcDNA3.1(+)-EGFP组相比差异无统计学意义(P0.05) 结论： 1.成功构建pcDNA3.1(+)-UCH-L3-EGFP质粒。 2.雷帕霉素可诱导NCI-H460细胞发生自噬,并且在自噬过程中UCH-L3蛋白表达下调。 3.过表达UCH-L3可使雷帕霉素诱导的细胞自噬过程得到抑制,但其作用的具体机制还不清楚,有待于进一步的研究。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

【共引文献】

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本文编号：1199942