弓形虫pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4基因疫苗的构建及动物免疫保护性的研究

发布时间：2017-11-19 09:26

本文关键词：弓形虫pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4基因疫苗的构建及动物免疫保护性的研究

【摘要】：目的应用PCR技术体外扩增弓形虫表面抗原SAG1和SAG4目的基因片段，构建pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4基因疫苗，分别及混合免疫小鼠后以动物的血清抗体和对弓形虫感染的保护性为指标，评价疫苗的免疫效果，为弓形虫病DNA疫苗应用奠定基础。方法提取弓形虫RH株的基因组DNA，根据GenBank中弓形虫RH标准株的SAG1和SAG4基因序列分别各设计一对特异性引物，通过PCR体外扩增的方法获取目的基因片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、测序和BLAST同源比对分析鉴定。经鉴定的SAG1和SAG4基因片段回收纯化后连接至PEGM-T Easy载体中构建克隆重组质粒PEGM-T Easy-SAG1和PEGM-T Easy-SAG4，克隆质粒经菌落PCR、双酶切和测序鉴定后，分别用限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ和BamHⅠ、XbaⅠ从PEGM-T Easy-SAG1和PEGM-T Easy-SAG4中切下SAG1和SAG4基因片段，亚克隆至质粒pVAX1中，用菌落PCR、双酶切进行鉴定。鉴定后，大量提取重组质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4以制备基因疫苗。将制备的基因疫苗pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4分别及混合后经后肢肌肉注入Bala/c小鼠3次，，每次间隔2W，小鼠断尾取血，分离血清ELISA法测定弓形虫抗体，末次免疫后2W用弓形虫RH株速殖子攻击，分别观察小鼠的发病及死亡情况。结果提取的基因组DNA用特异性引物进行PCR体外扩增后获得SAG1基因片段长772bp，SAG4基因片段长511bp，测序后经BLAST同源性分析显示获得的两个目的片段与弓形虫RH标准株相对应的SAG1基因和SAG4基因的cDNA同源性分别为99%和100%。克隆重组质粒PEGM-TEasy-SAG1和PEGM-T Easy-SAG4经菌落PCR和双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示在800bp和500bp处有特异性条带，测序结果也显示SAG1和SAG4目的基因片段已正确地插入克隆质粒T7启动子下游，并含有HindⅢ、BamHⅠ和BamHⅠ、 XbaⅠ酶切位点。真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4经菌落PCR和双酶切鉴定后琼脂糖凝胶电泳显示分别在800bp和500bp处得到与预期大小一致的目的基因片段条带SAG1和SAG4。核酸疫苗pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4单价及混合多价疫苗免疫小鼠后，各组的血清抗体OD值均为阴性。攻击实验中混合多价疫苗比单价疫苗存活时间长，核酸单价疫苗pVAX1-SAG1比pVAX1-SAG4存活时间长，差异有统计学意义（p0.05）。结论用PCR方法成功从弓形虫RH株速殖子基因中扩增出SAG1和SAG4基因片段，构建了克隆质粒PEGM-T Easy-SAG1和PEGM-TEasy-SAG4及真核表达质粒pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4。pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG4重组质粒能诱导动物产生保护性免疫力，pVAX1-SAG1单价核酸疫苗的免疫保护保护性比pVAX1-SAG4好，而两者混合组成的多价疫苗效果则比各自的单价疫苗更理想。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R382.5

【参考文献】

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