识别子孢子TLRs的鉴定及其抑制疟原虫肝期发育机制的研究

发布时间：2017-11-20 15:37

  本文关键词：识别子孢子TLRs的鉴定及其抑制疟原虫肝期发育机制的研究

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【摘要】：Toll样受体(TLRs)是固有免疫系统中非常重要的一类模式识别受体(PRRs),它们通过识别病原相关模式分子(PAMPs)启动固有免疫从而抵抗外界病原体入侵。因此，天然免疫识别病原体成分成为宿主对病原体产生免疫应答的第一步。迄今为止，在对疟原虫天然免疫识别的研究中，鉴定出TLR2、TLR4以及TLR9参与了宿主固有免疫对疟原虫红内期的识别，而对于其他TLRs是否参与识别红内期成分仍不清楚。更重要的是由于受到高纯度子孢子分离纯化的技术限制，对TLR受体是否参与天然免疫系统识别疟原虫子孢子未见报道。本研究利用过DE52柱的方式分离获得了高纯度的子孢子，通过建立检测NF-κB及IFN-β报告基因活化的双荧光素酶平台和蚊叮咬小鼠的疟疾感染平台和改进子孢子分离纯化方法，发现TLR2能够识别子孢子成分，并对其在疟原虫肝期生长发育中的作用和机制进行了初步研究。 一、利用双荧光素酶平台筛选可以识别疟原虫成分的TLR： 1、检测TLRs活化双荧光素酶平台的建立:构建小鼠重组TLR1，TLR3，TLR4，MD-2，TLR5，TLR6，TLR7，TLR9真核表达质粒，与NF-κB和IFN-β报告基因共转染293FT，建立了检测TLR活化的双荧光素酶平台。 2、识别子孢子TLRs的鉴定：利用解剖过柱的方法分离纯化约氏疟原虫BY265株子孢子，反复冻融制备了裂解产物，经检测子孢子裂解产物内毒素含量仅为11EU/ml；对感染小鼠心脏取血，经超声制备了裂解产物。利用双荧光素酶平台对裂解产物进行实验，结果发现，TLR2、TLR2/1、TLR2/6、TLR4以及TLR9可被约氏疟原虫17XL株红内期成分所活化，说明成功建立了双荧光素酶平台；而约氏疟原虫BY265红外期子孢子反复冻融产物仅以通过TLR2、TLR2/1及TLR2/6而不是其他TLR受体活化NF-κB(P0.05)。 3、约氏疟原虫子孢子以TLR2依赖的方式刺激腹腔巨噬细胞分泌促炎症因子：分离WT，TLR2-/-小鼠腹腔巨噬细胞，用制备好的约氏疟原虫子孢子裂解产物进行刺激，22-24h后，使用CBA Mouse Inflammation Kit检测培养上清细胞因子含量，结果发现子孢子依赖于TLR2信号通路促使巨噬细胞分泌IL-6、MCP-1和TNF-(P0.05)。 二、TLR2抑制肝期疟原虫发育及其机制研究： 1、约氏子孢子感染后，TLR2缺失导致肝期虫荷和原虫血症的增加：体内实验研究发现，在尾静脉注射子孢子及蚊叮咬感染实验中，TLR2和Myd88缺失小鼠的肝脏虫荷明显高于WT小鼠(P0.05)。而由于受到肝期虫荷的影响，TLR2缺失小鼠的原虫血症和死亡率都明显高于WT小鼠(P0.05)。 2、活化TLR2能够抑制约氏疟原虫肝期的生长发育：为了验证TLR2信号通路的作用，本研究将20μg TLR2激动剂LTA-BS、Pam3CSK4及FSL-1分别和子孢子一起经尾静脉注射至WT小鼠体内，随后观察小鼠肝脏虫荷发现，注射激动剂组小鼠肝脏虫荷相比未注射组都有不同程度的降低(P0.05)。表明活化TLR2信号通路能够抑制肝脏疟原虫的生长发育，降低虫荷。 3、约氏子孢子感染后，TLR2缺失导致肝脏促炎症因子的下调：对小鼠肝脏的促炎症因子mRNA水平进行染料q-PCR检测。发现无论采用尾静脉注射子孢子或是蚊叮咬方式感染，感染后的TLR2缺失小鼠比的感染后的WT小鼠，其肝脏中IL-6、TNF-、IFN-γ、IL-12p40和IL-10mRNA水平都有不同程度的下调(P0.05)。 4、TLR2的缺失同样促进伯氏疟原虫肝期的生长发育：为了探究TLR2信号通路在其他疟原虫种属感染中的作用，本研究采用自然叮咬感染的方式，使感染伯氏疟原虫ANKA株17天的雌性按蚊叮咬WT和TLR2缺失小鼠，42小时后，定量检测其肝脏虫荷，发现TLR2缺失小鼠肝脏虫荷及死亡率均高于WT小鼠(P0.05)。 本研究通过建立双荧光素酶平台的筛选，首次发现了疟原虫子孢子可以通过TLR2活化NF-κB，而TLR2缺失之后的小鼠抵御肝期疟原虫感染能力明显下降，其原因可能与TLR2缺失后子孢子无法通过该受体信号通路促进炎症因子的分泌，，从而导致虫荷增加，原虫血症及死亡率也相对增高相关。说明子孢子在入侵过程中活化TLR2对于小鼠抑制肝期疟原虫生长发育中是极其重要的。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R382.31

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本文编号：1207661