人组织激肽释放酶试剂盒的研发

发布时间：2017-11-24 05:19

  本文关键词：人组织激肽释放酶试剂盒的研发

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【摘要】：研究表明激肽,激肽-缓激肽系统在心脑血管系统疾病、糖尿病及其并发症、肿瘤等起作用,此外我们的前期研究证实,人激肽释放酶在血液中的含量与缺血性脑中风的相关性显示其可以作为脑卒中体外诊断的一项重要参与指标。鉴于多项研究及我们前期所作实验的结果,我们研发针对人组织激肽释放酶的试剂盒。 [目的]开发激肽释放酶含量测定ELISA试剂盒,用于诊断缺血性脑卒中、冠心病、糖尿病等疾病。 [方法](1)以pcDNA-HK为模板,用特异性引物PCR扩增KLK1目的基因,将鉴定结果为阳性的目的基因的重组质粒HK/4T1转化大肠杆菌DH5α,进行人组织激肽释放酶融合蛋白(HK-4T1)的原核表达及纯化,并且进一步优化条件。(2)单克隆抗体制备,以杂交瘤细胞注射小鼠,诱生腹水产生的单克隆抗体效价可到1：1×10∧5。用AKTA系统纯化后能得到纯度高、效价高的抗体,可用于ELISA检测。(3)制备多克隆抗体用于KLK1试剂盒包被孔板,以提高试剂盒检测的准确性。同时用未包被的酶标板做直接法ELISA实验。 [结果](1)将IPTG诱导表达的菌体进行SDS-PAGE电泳,与蛋白标准品比较,在相对分子质量55KDa处可见明显的高表达带。免疫印迹实验表明重组蛋白具有KK的抗原性。(2)相对于细胞培养基上清,小鼠腹水产生的单克隆抗体较易获得纯度高,效价高的抗体。(3)多抗包被的孔的OD值随着抗原浓度的降低有下降趋势,但线性关系较差；直接法的OD值在0.75ug/ml浓度以下的线性关系较好。 [结论]已经成功克隆并表达人组织激肽释放酶基因,在最佳条件下,初分离产品中,绝大部分比重为目的蛋白包涵体,对初产品的精细分离采用排阻色谱和亲和色谱完成,以便进一步提高目的蛋白的比重,已经初步建立起对人组织激肽释放酶的高效ELISA检测试剂盒,为下一步进行血浆激肽释放酶含量的检测做好铺定,接下来的工作主要集中在将产品工业化及提高测试方法的精确度及可重复性上
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

【共引文献】

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1 简嘉;李平华;;活性氧清除剂对实验性视神经炎作用的研究进展[J];国际眼科杂志;2007年02期

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4 潘树义,王苏平,余磊,廖华,秦建强,钟世镇;神经生长因子对脑保护作用的对比研究[J];中国临床神经科学;2002年02期

5 秦伟,罗勇,罗艳;载药纳米粒在治疗中枢神经系统疾病中的应用前景[J];国外医学(脑血管疾病分册);2004年11期

6 Praveen Ballabh;Alex Braun;Maiken Nedergaard;周旭平;包仕尧;;血脑屏障 结构、调控和临床意义[J];国际脑血管病杂志;2006年02期

7 杨帆;姚玉宇;马根山;;激肽-激肽释放酶系统在心血管疾病发展中的重要作用[J];东南大学学报(医学版);2013年05期

8 赵岩;徐玲;张习红;;尤瑞克林联合依达拉奉对急性颈内动脉系统梗死患者神经元特异性烯醇化酶水平及其预后的影响[J];淮海医药;2014年02期

9 王泽祥;刘诗翔;;脑缺血后适应对缺血再灌注脑组织保护作用的研究进展[J];神经病学与神经康复学杂志;2010年04期

10 蒋中凤;许晓辉;王东生;王为民;上官稳;许红霞;;脑出血患者血清MMP-9、IL-6、TNF-α变化及其与灶周水肿的关系[J];山东医药;2009年21期

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1 董智强;陈旭;曹立梅;;神经激肽B1受体与突触可塑性[A];第十三次全国中西医结合虚证与老年医学学术研讨会论文集[C];2013年

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1 曹海涛;ACE、CYPllB2和HSP70基因与“沙漠人”高血压、动脉粥样硬化的关联研究[D];新疆医科大学;2011年

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3 张更申;胡椒碱对实验性家兔蛛网膜下腔出血后迟发性脑血管痉挛作用机理研究[D];河北医科大学;2006年

4 韩艳秋;实验性糖尿病大鼠神经病变及胰激肽原酶神经保护作用研究[D];吉林大学;2006年

5 胡薇薇;肥大细胞在脑缺血中的变化及其对神经元的作用[D];浙江大学;2007年

6 罗伟;高迁移率族蛋白B1在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛炎症反应中的作用及机制研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年

7 唐敏;缓激肽受体在神经元和星型胶质细胞缺氧复氧损伤中的作用及机制[D];复旦大学;2008年

8 吴平;ApoE基因多态性和cav-1基因上游PPC长度多态性与AD、MCI和VD的相关性研究[D];复旦大学;2009年

9 孙昆峰;鸭瘟病毒gC基因疫苗在鸭体内分布规律及gC、gE基因缺失株的构建和生物学特性的初步研究[D];四川农业大学;2013年

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2 陈鑫;糖尿病肾病患者血循环激肽释放酶1水平及其临床意义的研究[D];桂林医学院;2010年

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5 崔巍;脑出血患者灶周水肿变化规律及相关影响因素的研究[D];郑州大学;2010年

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10 金春雷;Carnosine对大鼠杏仁核点燃癫痫发作以及结节乳头核在癫痫后保护中的作用[D];浙江大学;2006年

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本文编号：1221152