Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶HATL4的表达及其单克隆抗体的研制

发布时间：2017-12-02 00:04

  本文关键词：Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶HATL4的表达及其单克隆抗体的研制

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【摘要】：目的：II型跨膜丝氨酸蛋白酶（Type II Transmembrane Serine Proteases，TTSPs）是一类通过氨基末端跨膜区域锚定在细胞膜上的丝氨酸蛋白酶，在哺乳动物的许多生物学过程中扮演着重要角色，其功能异常可导致癌症、缺铁性贫血、耳聋、心血管疾病等。在人类，TTSPs共有17个成员，其中人呼吸道胰蛋白酶样蛋白酶（Human airwaytrypsin-like protease，HAT）最早发现存在于慢性呼吸道疾病患者的痰液中，在粘液生成、水解流感病毒的血凝素抗原以及细胞迁移和基底膜的降解中起到关键性的作用。HATL4蛋白酶为TTSPs中HAT/DESC亚家族中的一个成员，目前国内外尚未见有关HATL4蛋白酶生物学功能的任何报道，对它的生物学活性和功能知之甚少。本研究首先探讨HATL4在人恶性血液病细胞系和白血病患者骨髓细胞中的表达；然后表达、纯化重组HATL4，免疫小鼠，研制抗人HATL4单克隆抗体；并运用蛋白质免疫印迹法、流式细胞术等实验方法对所制备的抗体进行验证，为进一步研究HATL4的生物学功能提供工具。 方法： （1）利用反转录PCR（RT-PCR）技术检测HATL4在人恶性血液病细胞系和白血病患者骨髓细胞中的表达； （2）利用RT-PCR从人成巨核细胞白血病细胞系MEG-01中扩增编码HATL4蛋白的蛋白酶活性区域片段，与克隆载体pMD18-T simple连接，经Sac I、Hind III双酶切鉴定后送测序，然后定向插入原核表达载体pQE30，并在原核表达菌株M15中实现重组蛋白6×His-HATL4的表达； （3）利用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白，并对纯化产物复性和浓缩；用Westernblotting分析纯化产物； （4）以纯化的HATL4融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴细胞杂交技术，将免疫小鼠的脾脏细胞与同种系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。采用ELISA方法，用纯化的重组HATL4融合蛋白筛选只与HATL4反应的能持续分泌抗人HATL4单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过Protein-G亲和层析柱纯化腹水，SDS-PAGE分析纯化结果。 （5）HATL4真核表达载体的构建：采用RT-PCR技术从人成巨核细胞白血病细胞系（MEG-01）中扩增HATL4基因cDNA全长基因片段，经过酶切鉴定后，克隆至pcDNATM3.1/V5-HisTOPO TA载体，测序鉴定。 （6）HATL4在CHO细胞的表达：根据Fermentas转染试剂说明书，将HATL4真核表达载体转染至中国仓鼠卵巢细胞（CHO），用蛋白质免疫印迹法检测重组蛋白的表达。 （7）HATL4抗体的鉴定：流式细胞术及免疫荧光等实验方法对所制备的抗体进行鉴定。 结果： （1）采用RT-PCR技术对18种人恶性血液病细胞系和81例恶性血液病患者骨髓细胞中HATL4mRNA的表达进行分析，发现HATL4mRNA在急性髓细胞白血病（Acute Myelocytic Leukemia，AML）患者骨髓细胞中表达特异性增高。 （2）构建了HATL4原核表达质粒，并在M15中成功表达HATL4融合蛋白；SDS-PAGE显示该融合蛋白分子量约26kDa，与预期结果相符；融合蛋白以包涵体形式存在，，表达产量约占菌体总蛋白60%；经纯化、复性后的融合蛋白纯度95%，Westernblotting结果显示一条his抗体特异性识别的蛋白条带。 （3）成功获得分泌稳定的单克隆抗体杂交瘤细胞株5株，分别命名为2E6、2D7、2H10、3C10、6D3。经过Protein-G亲和层析柱纯化后的5株单克隆抗体分别在还原剂与非还原剂条件下进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色。非还原条件下可见一条150kDa的条带，还原条件下可见分子量55kDa的重链和25kDa的轻链。 （4）成功构建含有HATL4全长cDNA的真核表达载体。转染CHO细胞，Westernblot结果显示，V5抗体能检测到转染后细胞裂解液中的约50kDa的HATL4蛋白条带。 （5）流式细胞术检测表明5株单抗均能特异性识别CHO细胞中表达的重组HATL4。在白血病细胞株中，也检测到HATL4在MEG-01中表达率高达85.7%，在K562及KU-812中表达较弱，分别为4.7%和19.7%，而在NB4中几乎没有表达，只有1.23%。免疫荧光发现我们研制的抗体能特异性识别HATL4，并发现HATL4定位于肿瘤细胞膜表面。 结论：本研究首次发现HATL4在急性髓细胞白血病中表达增高；成功表达、纯化和复性了HATL4融合蛋白；并运用杂交瘤技术成功筛选并制备出5株抗HATL4的单克隆抗体细胞株；经蛋白质免疫印迹法、流式细胞术和免疫荧光鉴定，制备的5株单克隆抗体均能特异性识别HATL4蛋白。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

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