SD大鼠大脑皮质EAN三细胞网络模型构建过程中内皮细胞细胞质空泡化现象观察及结果分析

发布时间：2017-12-03 06:12

  本文关键词：SD大鼠大脑皮质EAN三细胞网络模型构建过程中内皮细胞细胞质空泡化现象观察及结果分析

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【摘要】：目的：随着人口老龄化加剧和群众生活方式的改变，大脑疾病发病率呈显著上升趋势。虽然治疗该类疾病的药物研发较多，但是由于许多药物不能够通过血脑屏障或通过率较低从而达不到控制疾病的效果。因此大脑疾病的治疗及其预防已成为当今医学界一大难题。我们原代培养Sprague Dawley（SD）大鼠大脑皮质细血管内皮细胞（Endothelial cells, E）、星形胶质细胞（Astrogcyte,A）和神经元（Neuron, N）并利用Transwell系统建立EAN三细胞网络模型，尝试为治疗大脑疾病研究提供新的有效工具。本次实验室在EAN三细胞网络模型基本建立成功的基础上，针对该模型建立过程中出现的不稳定性因素进行观察和结果分析，完善模型建立的条件和方法，从而建立一种更加完善稳定的体外系统模型，为大脑疾病机制研究提供更可靠、更理想的新方法，对新药物的研发和筛选提供新的评价体系。 方法：1、本次实验首先提取原代SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞、毛细血管内皮细胞和神经元，并分别用胶质原纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidicprotein,GFAP）、血管性血友病因子（von Willebrand Factor protein, vWF）和微管相关蛋白2（Microtubule-associated protein2, MAP2）相关抗体对以上单独培养的三种细胞进行细胞免疫荧光染色以及DAPI细胞核染色，进一步鉴定细胞的纯度。2、然后将三种不同时间提取的原代细胞按照一定的时间空间顺序先后种植于包被胶原蛋白Ⅳ的Transwell系统中，建立EAN三细胞网络模型系统。3、EAN三细胞网络模型系统建立后，测量模型从共培养开始每天跨内皮细胞电阻值（Trans-endothelial electrical resistance, TEER）及共培养第5天荧光素钠渗透性系数(Permeability NaF, Pe NaF)，对EAN三细胞网络模型内皮细胞紧密连接形成结构和形态学观察。4、针对每次实验出现的不稳定性问题，整理总结以往7次原始数据及图片，使用相关的统计学方法和图像分析软件Image-Pro-Plus6.0(IPP)对其不稳定因素测量及结果分析。 结果：1、我们成功提取原代SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞、毛细血管内皮细胞和神经元，并初步建立了EAN三细胞网络模型。2、测量不同模型共培养5天后的跨内皮细胞电阻值和荧光素钠渗透性系数。EAN、EA、EN和E的跨内皮细胞电阻值分别是22.77±1.71×cm2、19.47±1.4×cm2、11.55±0.93×cm2和8.42±1.63×cm2。EAN、EA、EN和E荧光素钠数值依次是45.05×106cm/s、76.08×106cm/s、52.1×106cm/s和167.1×106cm/s。3、总结7次的实验结果，发现了含有空泡现象的实验4次、模型建立后测量跨内皮细胞电阻值3次，模型建立后测量荧光素钠渗透性系数4次。经IPP软件对第3次、第5次、第6次和第7次的原始图片测量分析，得出结果四次空泡与细胞的数量比总和依次为0.7734、9.2202、16.9858和0.455，空泡与细胞的面积比的总和依次为0.00629、0.0397、0.09577和0.002004；测量第4次、第5次第7次EAN三细胞网络模型的跨内皮细胞电阻值，实验结果得出最高的电阻值分别为49.25×cm2，22.77×cm2和47.28×cm2；测量第3次、第4次、第5次、第7次EAN三细胞网络模型建立后荧光素钠渗透性系数，实验结果依次为44.4×106cm/s，39.7×106cm/s，42.5×106cm/s和40.76×106cm/s。 结论：1、SD大鼠大脑皮质EAN三细胞网络模型所测的跨内皮细胞电阻高于其他细胞培养模型，所测的荧光素钠渗透性系数低于其他细胞培养模型，因此推断EAN三细胞网络模型的建立比其他模型更接近体内的大脑内环境。2、在模型构建过程中发现单独培养原代内皮细胞有时会出现细胞质空泡现象，跨内皮细胞电阻值和荧光素钠渗透性系数的数值不稳定的现象。3、单独培养的内皮细胞出现了空泡现象可能对整个模型建立后出现跨内皮细胞电阻值偏低及荧光素钠渗透性系数偏低有影响。下一步实验应尽量完善内皮细胞培养的方法，保证毛细血管内皮细胞稳定生长，纠正这些不稳定因素，从而建立一种更加完善、稳定的体外系统模型，对新药物的研发和筛选提供新的评价体系，为大脑疾病研究提供有效的工具。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2

【参考文献】

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1 井庆川;赵静;赵宝祥;张尚立;苗俊英;;利用γ-丁内酯衍生物研究空泡化与细胞分化[J];山东大学学报(理学版);2008年03期

2 陈圣敏;;幽门螺杆菌空泡毒素VacA致病机制研究[J];中西医结合研究;2010年01期

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本文编号：1247701