RACK1蛋白与CLIC1蛋白的相互作用

发布时间：2017-12-04 11:30

  本文关键词：RACK1蛋白与CLIC1蛋白的相互作用

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【摘要】：目的通过间接免疫荧光法，免疫共沉淀法，观察在哺乳动物细胞中活化的蛋白激酶C受体1(RACK1)蛋白和氯离子胞内通道1(CLIC1)蛋白的表达与定位，验证在体内是否存在相互作用，，利用GST-Pulldown法研究两蛋白在体外是否存在相互作用。 方法设计RACK1的上下游引物，以RACK1的全长cDNA序列为模板，PCR扩增出RACK1序列，构建到pCDNA3.1(+）真核表达载体和GST原核表达载体中。酶切鉴定正确的pCDNA3.1-FLAG-RACK1、 pCDNA3.1-HA-RACK1及GST-RACK1重组质粒送到生工公司测序。经BLAST比对，测序正确的pCDNA3.1-FLAG-RACK1或pCDNA3.1-HA-RACK1和pCDGFP-CLIC1分别转染到COS7细胞。观察各自空间分布，再共转染到COS7细胞，观察在RACK1与CLIC1蛋白在细胞内的共定位情况。转染pCDNA3.1-FLAG-RACK1到HEK293T细胞，利用Western blot法检测蛋白表达情况，并与pCDGFP-CLIC1共转染到293T细胞，用免疫共沉淀验证两者是否存在相互作用。GST-RACK1转化到BL21感受态细胞中，制备融合蛋白，同时转染pCDGFP-CLIC1到293T细胞通过GST-Pulldown技术检测两者在体外相互作用情况。 结果酶切鉴定与公司测序的结果表明重组质粒pCDNA3.1-FLAG-RACK1、pCDNA3.1-HA-RACK1与GST-RACK1构建成功。荧光显微镜检测RACK1与CLIC1蛋白在细胞核和细胞质中都有分布，并且两者在COS7细胞核和细胞质中存在重叠分布。Western blot法检测到RACK1蛋白在239T细胞中表达，免疫共沉淀法证明带FLAG标签的RACK1蛋白可以把CLIC1蛋白沉淀下来，在适当浓度IPTG诱导下，GST-RACK1融合蛋白表达成功，GST-Pulldown实验验证了体外条件下RACK1蛋白能够把CLIC1蛋白下拉下来。 结论间接免疫荧光实验的结果说明了RACK1蛋白和CLIC1蛋白在细胞核与细胞质中存在共定位，免疫共沉淀和GST-pulldown实验证明了RACK1蛋白和CLIC1蛋白在体外和细胞内都存在相互作用。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q78;R3411

【参考文献】

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本文编号：1250867