Mas基因沉默对血管紧张素-（1-7）拮抗血管紧张素Ⅱ诱导的肾间质成纤维细胞活化的影响

发布时间：2017-12-06 20:34

  本文关键词：Mas基因沉默对血管紧张素-（1-7）拮抗血管紧张素Ⅱ诱导的肾间质成纤维细胞活化的影响

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【摘要】：目的:探讨Mas基因沉默后对血管紧张素-(1-7)[angiotensin-(1 7)，Ang-(1-7)]拮抗血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)诱导的大鼠肾间质成纤维细胞(NRK-49F)活化的影响。方法：在体外传代培养NRK-49F，当培养瓶中细胞生长至70-80%融合后，用细胞培养基稀释成密度为1×105/ml的细胞悬液并接种于六孔板中用于实验。在我们的前期实验中根据Mas基因序列设计合成3对不同位点的小分子干扰RNA(small interfering RNA， SiRNA)并采用HiPerFectTransfection Reagent瞬时转染NRK-49F，48h后通过用半定量PCR(semi-quantitative PCR，RT-PCR)法检测Mas mRNA的表达和用蛋白免疫印记法(Western blot)检测Mas蛋白的表达，已证实MasSiRNA能有效的沉默Mas基因的表达并筛选出了对Mas基因沉默效果最佳的一对Mas SiRNA序列。为进一步研究有效Mas SiRNA沉默Mas基因后对Ang-(1-7)拮抗AngⅡ诱导的NRK-49F活化的影响，我们将已筛选出的有效序列Mas SiRNA瞬时转染NRK-49F，根据不同的干预因素实验分为6组：①正常对照组(NG):细胞中仅加入含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM-F12培养基，即正常培养基，②AngⅡ组：细胞中加入含终浓度为10-6mol/LAngⅡ的正常培养基，③Ang-(1-7)组：细胞中加入含终浓度为10-5mol/L Ang-(1-7)的正常培养基，④AngⅡ+Ang-(1-7)组：细胞中同时加入含终浓度为10-6mol/LAngⅡ和终浓度为10-5mol/LAng-(1-7)的正常培养基，⑤阴性SiRNA对照组：细胞在阴性序列siRNA转染48h后加入含10-6mol/L AngⅡ和10-5mol/L Ang-(1-7)的正常培养基，⑥Mas SiRNA转染组：细胞在有效Mas siRNA转染48h后加入含10-6mol/L AngⅡ和10-5mol/LAng-(1-7)的正常培养基。将上述各组细胞分别培养72h后，采用细胞免疫化学法检测NRK-49F活化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)的表达，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中细胞外基质成分Ⅰ型胶原(collagenⅠ，ColⅠ)的含量。结果：细胞免疫化学法检测结果表明有效Mas SiRNA转染组在加AngⅡ+Ang-(1-7)干预72h后，显微镜下可见细胞肥大，细胞胞浆所占体积比例增多，，在胞浆内能观察到棕黄色颗粒，界限清楚，与AngⅡ组的细胞形态相似，经半定量分析数据结果显示较非转染AngⅡ+Ang-(1-7)组和阴性SiRNA转染组α-SMA表达增加，差异有统计学意义(P0.05)；而AngⅡ+Ang-(1-7)组和阴性SiRNA转染组α-SMA的表达无明显差异(P0.05)，正常对照组与Ang-(1-7)组几无α-SMA的阳性表达。ELISA检测结果表明细胞加AngⅡ+Ang-(1-7)干预72h后，有效Mas SiRNA转染组较非转染AngⅡ+Ang-(1-7)组和阴性SiRNA转染组细胞上清液中ColⅠ的含量明显升高，差异有统计学意义(P0.05)；而AngⅡ+Ang-(1-7)组和阴性SiRNA转染组上清液中ColⅠ的含量无明显差异(P0.05)，正常对照组与Ang-(1-7)组细胞上清液中仅有基础量的ColⅠ分泌。结论：通过Mas SiRNA有效序列干扰NRK-49F中Mas基因的表达后，Ang-(1-7)拮抗AngⅡ诱导的NRK-49F活化作用明显减弱。提示Ang-(1-7)可能通过作用于Mas受体发挥其拮抗AngⅡ对NRK-49F的激活作用。
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

【参考文献】

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本文编号：1259911