RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白原核表达、纯化及鉴定

发布时间：2017-12-08 03:10

  本文关键词：RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白原核表达、纯化及鉴定

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【摘要】：目的构建RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法利用重叠延伸PCR获得目的融合基因片段RGD-r SAK-α1M,插入带有His-GST标签的原核高效可溶性表达载体PEGX-6P-1中。经酶切鉴定后,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,经Ni+亲和层析柱纯化后用3C蛋白酶切除重组蛋白的His-GST标签,再利用DEAE离子交换柱和分子筛纯化蛋白。最后应用纤维蛋白平板溶圈法和血小板聚集抑制试验分别测定评价重组融合蛋白的溶栓活性和抗血小板聚集作用。结果 1)成功构建了RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白。2)实现了目的融合蛋白在大肠杆菌上清液中的高效表达,并纯化了融合蛋白。3)体外实验表明纯化后的融合蛋白纤溶活性同尿激酶标准品无明显差异。4)融合蛋白抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶明显提高。结论经文献检索确认为首次获得了纯化的RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白,并验证了其纤溶活性和尿激酶标准品无明显差异,而抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶增强,为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。
【作者单位】： 重庆医科大学附属第一医院心内科;重庆医科大学感染病性疾病分子生物实验室;
【基金】：重庆市科委国际合作项目(cstc2012gg-gjhz0025) 重庆市卫生局重点项目(20111025) 国家临床重点专科建设项目[财社(2011)170号]
【分类号】：R3411
【正文快照】： 葡激酶(staphylokinase,SAK)作为临床溶栓治疗的一线用药,是由金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种蛋白质,不仅具有高效的纤溶活性和纤维蛋白专一性,且不会引起全身纤溶亢进[1],免疫原性及血管开通后再梗塞是限制其临床使用的主要原因[2-3]。研究发现利用基因融合构建的融合

【参考文献】

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【共引文献】

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本文编号：1264810