Kindlin-2与Prdx4之间的相互作用研究

发布时间：2017-12-11 12:33

  本文关键词：Kindlin-2与Prdx4之间的相互作用研究

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【摘要】：Kindlin是上世纪50年代新发现的黏着斑蛋白家族,到目前为止,已确定该家族含有3个成员(Kindlin-1, Kindlin-2, Kindlin-3)。越来越多的证据表明Kindlins通过整合素在细胞黏附中起到重要作用,已有研究证实它们与皮肤疾病发生、心血管生成、免疫系统功能、肿瘤的侵袭、肿瘤耐药等有密切关系,它们作为信号分子参与了细胞黏附、迁移、增殖和分化的调控。 Kindlin家族不仅具有高度的同源性,还具有高度的保守性。Kindlin-2与Kindlin-1蛋白有62%的氨基酸相同,Kindlin-3与Kindlin-1有49%的氨基酸相同,Kindlin-2与Kindlin-3有53%的氨基酸相同。Kindlin含有一个典型的FERM结构域,这种结构多见于细胞骨架蛋白。它由3个亚结构域组成,分别为F1、F2、F3,在核心序列前往往有F0亚结构域。Kindlins中的F3与踝蛋白(talin) FERM中的F3高度相似,同样含有磷酸酪氨酸结合区(phosphotyrosine-binding domain, PTB),这种结构域可结合整合素β3亚基胞质尾区。 Kindlin-2定位于细胞-细胞外基质黏着点,直接与整合素连接激酶(integrin-linked kinase, ILK)和黏附结构蛋白相互作用,并且Kindlin-2或黏附结构蛋白的下调可导致细胞延展受损。Kindlin-1和Kindlin-2都可以通过结合整合素胞质尾段定位于黏着斑。Kindlin-2连接黏附结构蛋白,黏附结构蛋白结合血管扩张激活的磷酸蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein, VASP)和细丝蛋白(filamin),成为细胞-基质黏附复合体与肌动蛋白细胞骨架之间的重要连接。Kindlin-2对整合素的激活起着至关重要的作用。Kindlin-2的信号传导分为两部分,即信号由内到外传导和由外到内的传导过程。尽管多种蛋白质都能与β整合素胞内段相互作用,但在Kindlin的功能得到阐明之前,只有踝蛋白被确切证实能够触发整合素活化。然而事实上,在小鼠基因敲除的研究中,证实了Kindlin才是整合素活化所必需的。 Kindlin-2有可能在癌症的发生和进展中也扮演着重要角色。许多研究都表明,Kindlin-2的表达水平改变与某些肿瘤密切相关。我们的前期研究也证实,Kindlin-2的表达水平不但与前列腺癌的恶性程度密切相关,而且调控着前列腺癌细胞对顺铂的敏感性。另外,Kindlin-2在不同肺癌细胞系中表达不同,且其过表达可显著促进U-1752细胞的迁移。Kindlin家族成员可能通过与整合素的作用来参与肿瘤侵袭和转移过程的调节,但其机制还远未阐明。 鉴于Kindlin-2在整合素活化中的关键性作用以及与某些肿瘤的发生发展的密切相关性,我们开展了寻找新的Kindlin-2相互作用蛋白的工作。在前期研究中,我们利用特异性抗Kindlin-2抗体对前列腺癌细胞系PC-3细胞裂解物进行pulldown,样品利用2-D荧光差异蛋白表达分析系统(2-DDIGE)进行分析。2-DDIGE系统是在传统双向电泳技术的基础上,结合了多重荧光分析的方法,在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记的样品,获得差异点后,我们利用全自动凝胶取点、酶解、点样工作站对差异点进行处理,随后用4800型MALDI-TOF/TOF分析仪对差异点进行质谱鉴定。在得出的差异点中,其中一个令人感兴趣的蛋白是过氧化物酶蛋白(peroxiredoxin, Prdx)家族的一个成员Prdx4。 过氧化物酶蛋白是一个多功能蛋白家族,它有清除生物体内氧自由基的作用,研究表明长期的体能锻炼能上调过氧化物酶蛋白的表达,以及结合许多慢性疾病过程中所产生的氧自由基,同样在免疫应激条件下,过氧化物酶蛋白呈过氧化状态以此保护机体免受损伤。过氧化物酶蛋白家族成员分子量大小在20～30kDa范围内,且广泛分布在生物体内。在大多数人类细胞中,它占到可溶性蛋白的0.1-1%,并且是红细胞胞质的第三大蛋白。过氧化物酶蛋白家族的六个亚型在人体的定位有显著的区别,根据该家族蛋白参与氧化还原反应的半胱氨酸残基数目,将其家族分为三类：即典型的2-Cys-Prdx (Prdx1～4),非典型的2-Cys-Prdx (Prdx5),以及1-Cys-Prdx (Prdx6)。 越来越多的证据提示Prdx的表达水平与肿瘤密切相关,甚至有人提出Prdx可作为肿瘤标志物。例如,Prdx3和Prdx4在前列腺癌中的表达都明显增加,且Prdx4被提出可作为前列腺癌活检的生物标志物。另外,在肺癌中也发现Prdx4的表达上调。细胞过表达Prdx2时对顺铂的耐受性增加,而下调其表达则促进顺铂诱导的细胞死亡。鉴于Prdx4参与氧化应激且与肿瘤之间的密切关系,且我们的前期研究发现Kindlin-2也与肿瘤的发生发展具有高度相关性,因而我们推测Prdx4与Kindlin-2的相互作用可能参与了炎症导致的肿瘤发生发展的调控。 基于以上认识,我们在本课题研究中,开展了以下工作： 第一部分：pmcherry-Nl-Prdx4和pEGFP-C3-Kindlin-2载体的构建及鉴定 将带有红色荧光蛋白pmcherry和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的融合蛋白表达载体中分别引入人Prdx4和Kindlin-2全长序列,完成了融合蛋白表达载体pmcherry-N1-Prdx4和pEGFP-C3-Kindlin-2的构建。融合了EGFP的Kindlin-2和1ncherry的Prdx4在细胞内具有高效的表达能力,且无细胞选择性。构建完成的pEGFP-C3-Kindlin-2和pmcherry-N1-Prdx4载体转染入宿主细胞后,不但有助于观察其细胞内定位情况,而且还可用于后续的功能实验和实时动态实验。 第二部分：Kindlin-2与Prdx4相互作用的验证 1、外源性免疫共沉淀验证Kindlin-2与Prdx4相互作用 为了明确Kindlin-2与Prdx4是否有相互作用,我们将HA标记的Prdx4载体与FLAG标记的Kindlin-2载体转染COS-7细胞后进行免疫共沉淀,并设单转染组作为对照,结果证实两者具有相互作用。鉴于Prdx4是一种过氧化物酶,我们想进一步了解氧化应激对两者的相互作用有何影响,选取90min作为刺激时间。结果发现,细胞在受到H202刺激后,两者的相互作用较刺激前显著增加。 2、内源性免疫共沉淀验证Kindlin-2与Prdx4相互作用 我们首先分别用NaAsO2刺激PC-3细胞0min、5min、15min、30min、45min、60min、90min和120min, Western blot检测了细胞内Kindlin-2和Prdx4的表达量,结果发现二者的表达量随着时间的延长并未发生变化。接着收取PC-3细胞做内源性的免疫共沉淀实验,选择NaAsO2刺激90min组,设不加刺激组和无关抗体组作为对照。结果证实两者具有相互作用,且细胞在受到NaAsO2刺激后两者的相互作用较刺激前显著增加,与外源性免疫共沉淀实验结果相一致。 第三部分：Kindlin-2和Prdx4在细胞内的共定位 1、外源性Kindlin-2与Prdx4在细胞内的共定位 我们将pEGFP-C3-Kindlin-2和pmcherry-N1-Prdx4共转染PC-3细胞,并检测到在细胞内皆有表达,然后用共聚焦显微镜观察二者在空间位置上有无共定位现象。同样选择NaAsO2刺激90min组,设不加刺激组和共转EGFP空载体与pmcherry-N1-Prdx4组作为对照。结果提示：pEGFP-C3-Kindlin-2在胞浆与胞核中均有分布,而pmcherry-N1-Prdx4主要分布在胞质,在NaAsO2未刺激组中pEGFP-C3-Kindlin-2和pmcherry-N1-Prdx4有少量的共定位,细胞在受到NaAsO2刺激后两者的共定位较刺激前显著增加。 2、内源性Kindlin-2与Prdx4在细胞内的共定位 我们进一步在PC-3细胞中做内源性的免疫荧光实验,分别用红色荧光和绿色荧光标记Prdx4和Kindlin-2,选择NaAsO2刺激90min组,设不加刺激组和单转EGFP空载体组作为对照。结果提示：在未受刺激时,Kindlin-2主要分布在胞浆和胞核中,而Prdx4只分布于胞浆中,Prdx4与Kindlin-2有少量共定位；NaAsO2刺激后两者共定位显著增强,与外源性结果相一致。 通过以上研究,我们得出以下几点结论： 1、完成pEGFP-C3-Kindlin-2和pmcherry-N1-Prdx4融合载体的构建及鉴定,并在PC-3细胞内有稳定的表达。 2、外源性免疫共沉淀实验初步证实H202刺激可明显诱导Kindlin-2与Prdx4的相互作用。 3、内源性免疫共沉淀实验证实NaAsO2刺激可显著增强Kindlin-2与Prdx4之间的相互作用。 4、荧光蛋白标记的Kindlin-2与Prdx4在空间位置上具有共定位现象,且在NaAsO2刺激后共定位增强。 5、内源性免疫荧光实验证实Kindlin-2与Prdx4有共定位现象,且在NaAsO2刺激后共定位增强。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

【共引文献】

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本文编号：1278503